總膽汁酸檢測

1、總膽汁酸測定 Biobase血清總膽汁酸的檢測酶比色法測定總膽汁酸循環(huán)法測定膽汁酸酶比色法測定總膽汁酸 【原理】 在3-羥類固醇脫氫酶(3-HSD)作用下，各種膽汁酸C3上位的烴基(3-OH)脫氫形成碳基(3=O)。同時NAD還原成NADH。隨后，NADH上的氫由黃遞酶催化轉(zhuǎn)移給碘化硝基四氮唑(INT)，產(chǎn)生紅色的甲臢。甲臢的產(chǎn)量與總膽汁酸(TBA)成正比，在500nm波長比色。反應(yīng)式如下：3-羥基膽酸 + NAD+ 3-氧代膽酸 + NADH + H+NADH + H+ + INT NAD+ + 甲臢 (紅色)Biobase酶比色法測定總膽汁酸【試劑】1試劑 黃遞酶 1 000U，NAD+

2、1 mmol，碘化硝基四氮唑(INT)0.5 mmol, 丙酮酸50 mmol溶于0.1mol pH 7.5 的磷酸緩沖液1 L中，加表面活性劑適量。2試劑 3- 羥類固醇脫氫酶(3-HSD) 2 000U溶于0.1mol pH 7.5的磷酸緩沖液中1 L中。3終止液 1 mol/L HCl。4標(biāo)準(zhǔn)液(50mol/L) 24.38 mg甘氨膽酸溶于1 L經(jīng)透析的混合血清中。Biobase酶比色法測定總膽汁酸【操作步驟】1手工法按表 加入物(ml) 測定 測定對照 標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn)對照血清 0.1 0.1 a標(biāo)準(zhǔn)液 0.1 0.1 b試劑 0.3 0.3 0.3 0.3 c試劑 0.1 0.1 d 去

3、離子水 0.1 0.1 e 混勻，37水浴10min，加終止液0.1ml，搖勻，500nm波長，以水校零，讀取各管A值。2自動分析法 一般無法做對照管，而是設(shè)置兩點終點法，讀取前后兩個吸光度A1和A2。具體按說明書要求。 Biobase酶比色法測定總膽汁酸【計算】手工法：TBA(mol/L) =A測定-A測定對照/A標(biāo)準(zhǔn)-A標(biāo)準(zhǔn)對照C標(biāo)準(zhǔn) 自動分析法：TBA(mol/L) =A測定2-A測定1/A標(biāo)準(zhǔn)2-A標(biāo)準(zhǔn)1C標(biāo)準(zhǔn)【參考范圍】 60名健康成人的空腹TBA為4.92.38mol/L, 中餐后2h TBA為8.222.91mol/L。Biobase酶比色法測定總膽汁酸 -臨床意義 膽汁酸的生成

4、和代謝與肝臟生理關(guān)系密切，血清膽汁酸水平是反映肝實質(zhì)損傷的一個重要指標(biāo)。血清總膽汁酸(TBA)測定對肝病的診斷有十分重要的價值。1急性肝炎：急性肝炎時血清TBA顯著增高，可達正常人水平的10100倍，甚至更高，急性肝炎初愈患者血清TBA由最初的高值幾乎與AST在同一時間降至正常水平，若持續(xù)不降或反而上升者則有發(fā)展為慢性的可能。2慢性肝炎：慢性肝炎分為輕度、中度和重度三個類型，空腹總膽汁酸(F-TBA)和餐后2h總膽汁酸(P-TBA)測定對慢性肝炎的分型、監(jiān)測、預(yù)后及療效有著重要意義。Biobase酶比色法測定總膽汁酸 -臨床意義3肝硬化：肝硬化時，肝臟對膽汁酸的代謝能力減低，血清TBA在肝硬化

5、的不同階段均增高，增高幅度一般高于慢性活動性肝炎。即使在肝硬化晚期亦如此。當(dāng)肝病活動降至最低時，膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶及堿性磷酸酶等指標(biāo)轉(zhuǎn)為正常，血清TBA仍維持在較高水平。4乙醇性肝?。阂掖夹愿尾⊙錞BA可增高，當(dāng)乙醇性肝病(包括肝硬化)發(fā)生嚴(yán)重的肝損傷時，血清TBA明顯增高，而輕、中度損傷增高不明顯。有報道認(rèn)為，血清TBA測定對乙醇性肝病肝細胞損傷診斷的可信度和靈敏度遠優(yōu)于各種酶學(xué)檢查和半乳糖耐量試驗等指標(biāo)，甚至建議將血清TBA再加上-氨基己糖苷酶作為乙醇性肝病的診斷指標(biāo)。有人認(rèn)為，餐后60min-TBA測定對乙醇性肝病診斷更有意義。Biobase酶比色法測定總膽汁酸 -臨床意義5中毒性肝?。涸?/p>

6、中毒性肝病時血清TBA也將異常。6膽汁淤積：血清TBA測定對膽汁淤積的診斷有較高靈敏度和特異性。肝外膽管阻塞及肝內(nèi)膽汁淤積包括急性肝炎、初期膽管性肝硬化、新生兒膽汁淤積、妊娠性膽汁淤積等均可引起TBA增高。在膽管阻塞的初期，膽汁分泌減少，使血清中的TBA顯著增高，且在阻塞的不同階段幾乎保持不變；而血清膽紅素水平則隨不同階段而變化。膽汁淤積患者肝組織中的膽汁酸含量明顯高于正常人。肝外阻塞經(jīng)引流緩解后，血清TBA水平迅速下降，而其它指標(biāo)則緩慢恢復(fù)。Biobase酶比色法測定總膽汁酸 -臨床意義 所有肝病中，餐后血清TBA水平及異常率均比空腹時測定更靈敏，有人甚至認(rèn)為餐后測定TBA對各種肝病的診斷靈

7、敏度和特異性高達100%，而同時測定空腹血清膽汁酸有40%的患者在正常范圍。急性肝炎是否轉(zhuǎn)為慢性，連續(xù)監(jiān)測餐后血清TBA可以觀察慢性過程，慢性活動性肝炎是否發(fā)生纖維化改變，連續(xù)監(jiān)測餐后血清TBA可以了解纖維化過程，不做肝活檢即可獲得肝損傷的程度。Biobase酶比色法測定總膽汁酸 -注意事項由于血清中TBA含量低，樣品中存在干擾物質(zhì)的影響相對就大，乳酸脫氫酶(LD)是主要的干擾物質(zhì)，由LD反應(yīng)中生成的NADH往往比TBA反應(yīng)中生成的量要大得多，因此測定前去除血清中LD的影響至關(guān)重要，方法有：血清67加溫30min；加草氨酸作為LD的封閉劑；堿或酸處理；用丙酮酸鈉抑制LD活性。上述5種方法中丙酮

8、酸鈉法最好，可免去前處理步驟，直接加入反應(yīng)體系，不影響體系的pH，且對反應(yīng)無干擾。血清中還存在其它脫氫酶(有相應(yīng)底物存在時)和還原性物質(zhì)，如不除去，測定結(jié)果會偏高。據(jù)無選擇的40例肝功能標(biāo)本的測定結(jié)果來看，平均干擾相當(dāng)于TBA 18mol/L，范圍在5.545mol/L之間。因此自動分析設(shè)計成雙試劑二步法，樣品先和不加3-HSD的體系孵育，使樣品中的干擾物質(zhì)先反應(yīng)，然后再加入3-HSD，啟動TBA反應(yīng)。Biobase酶比色法測定總膽汁酸 -注意事項脂肪酶、膽固醇(包括HDL-C、LDL-C)和甘油三酯測定試劑中均加有膽酸鹽，自動分析時會引起攜帶污染，必須引起注意。某些先進的儀器可以設(shè)定試劑針、

9、樣品針和反應(yīng)杯的補充清洗程序，亦可將TBA編排在上述有污染的項目前測定。對某些不具備上述功能的儀器，最好將TBA單批測定。試劑中加適量表面活性劑可防止甲臢 沉淀。Biobase酶比色法測定總膽汁酸（H)【方法學(xué)評價】1手工法測定TBA需做標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)的對照管，樣品和試劑用量大，試劑價格高，費用昂貴。分析儀測定能避免以上缺點，但去干擾能力不如手工法分析。血清TBA、尤其是正常血清TBA濃度低，因而檢測靈敏度至為關(guān)鍵，本法測定TBA50mol/L(標(biāo)本/試劑比為1：10)的標(biāo)準(zhǔn)液，A500nm(1cm)為0.1左右。所以低濃度時重復(fù)性較差，對31mol/L和157mol/L的樣品各1份，用手工法每天

10、上下午雙份測定，測10天，結(jié)果總CV分別為5.46%和2.79%。本法線性上限為300mol/L。 Biobase循環(huán)法測定膽汁酸 【原理】 膽汁酸被3-羥基類固醇脫氫酶及Thio-NAD+（二核苷酸氧化型）特異性地氧化，生成3-酮類固醇及Thio-NADH（二核苷酸還原型），此外，生成的3-酮類固醇在3-羥基類固醇脫氫酶及還原性輔酶（NADH）存在下，生成膽汁酸和NAD+。如此循環(huán)往復(fù)從而放大微量的膽汁酸量，在405nm處測定生成的Thio-NADH的吸光度變化，求得膽汁酸量。 Biobase循環(huán)法測定膽汁酸【試劑】1試劑 硫代-NAD 2mmol/L，Goods緩沖液 200mmol/L，

11、pH7.0。2試劑 3-HSD 15kU/L，NADH 3mmol/L,Goods緩沖液200mmol/L,pH8.0。3標(biāo)準(zhǔn)液 同比色法。【操作步驟】自動化分析法。反應(yīng)類型：速率法；反應(yīng)溫度：37；波長：405nm(主)/660nm(次)樣品3l；R200l；35min后加R50l,延遲時間1min讀數(shù)時間4min。Biobase循環(huán)法測定膽汁酸【計算】 TBA(mol/L) =A測定2-A測定1/A標(biāo)準(zhǔn)2-A標(biāo)準(zhǔn)1C標(biāo)準(zhǔn)【參考范圍】 40名健康成人的空腹TBA為3.712.98mol/L?！咀⒁馐马棥?血清TBA測定的酶循環(huán)法是一種通過脫氫酶-輔酶體系來循環(huán)底物的方法，因此要求這種酶對硫代

12、-NAD和NADH都應(yīng)有高親和力；反應(yīng)體系的pH和緩沖液應(yīng)允許正反應(yīng)(底物氧化)和逆反應(yīng)(底物還原)都能進行；還要求硫代-NAD和NADH濃度比例合適。這些條件使反應(yīng)的循環(huán)速率相當(dāng)快(約100次/min),在一定的反應(yīng)時間內(nèi)通過膽汁酸的重復(fù)反應(yīng)來增加硫代-NADH的量,提高反應(yīng)靈敏度。 Biobase循環(huán)法測定膽汁酸【評價】1干擾試驗結(jié)果表明 膽紅素850mol/L，血紅蛋白5g/L，抗壞血酸2.84mmol/L，乳酸24mmol/L，乳酸脫氫酶10 000U/L時，偏差均5%，說明幾乎不存在內(nèi)源性干擾,但外源性干擾如儀器的攜帶污染同樣存在,可用比色法中闡述的方法排除。 2本法靈敏度 TBA5

13、0mol/L(標(biāo)本/試劑體積比為1：83)的樣品，A410nm(1cm)為0.22左右。Beckman DU-640分光光度計手工操作的批內(nèi)CV2.0%，總CV4.0%，日立7170自動分析儀的批內(nèi)CV1.5%。本法(y)與比色法(x)比較y=0.921x1.426，r=0.9982，n=64。本法線性上限180mol/L。Biobase膽汁酸在肝內(nèi)合成、分泌、加工、轉(zhuǎn)化。當(dāng)肝細胞損傷或膽道阻塞時，會引起膽汁酸代謝障礙，出現(xiàn)血清膽汁酸增高 。所以測定血清中總膽汁酸可以作為判斷肝膽系統(tǒng)正常與否的重要信息。血清中TBA的診斷價值已得到廣泛重視，它不僅用于臨床診斷，而且還能反映病情和估計疾病預(yù)后。

14、TBA 臨床意義回顧臨床意義簡述 急性肝炎時，血清TBA濃度和ALT活力同時升高，分別在正常高限的3、4倍和30倍，兩者呈高度正相關(guān);慢性肝病時升高幅度雖不大，但均在正常值上限或2倍左右;肝硬化時ALT和肝功能指標(biāo)未發(fā)生明顯改變時，血清TBA濃度明顯升高。TBA是反映肝細胞損害非常靈敏的指標(biāo)。 肝硬化時，血清TBA比慢肝升高幅度大，而ALT和常規(guī)肝功能指標(biāo)未明顯變化，說明TBA濃度和ALT活力無相關(guān)關(guān)系，在肝硬化后期，TBA濃度改變更為明顯，表明TBA比ALT能更敏感地反映肝硬化患者病情。 孕婦測定TBA的重要性妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）是發(fā)生在妊娠中晚期以皮膚瘙癢和黃疸為特征的疾病，膽汁

15、淤積可導(dǎo)致膽小管內(nèi)形成膽栓，血清中TBA的濃度升高，如不能早期診斷及時對癥處理，可引起早產(chǎn)、胎兒窘迫、死胎、新生兒死亡及產(chǎn)后出血等母嬰不良后果，列入高危妊娠范疇。臨床對典型ICP診斷以出現(xiàn)皮膚瘙癢或不伴黃疸，血清TBA、ALT和ALP升高為依據(jù)，其中TBA測定作為ICP的敏感指標(biāo)，對ICP有重要和早期診斷價值。膽汁酸測定常見問題 結(jié)果出負(fù)值 試劑正常時，此現(xiàn)象出現(xiàn)幾率應(yīng)該很低；但也不能100%排除（尤其是標(biāo)本中TBA含量很低時）定期做試劑空白校準(zhǔn)是必要的。 交叉污染多項目同時測定時，TBA結(jié)果經(jīng)常會偏高；單獨復(fù)查時，結(jié)果又正常：是目前較常見的現(xiàn)象。這是因為：有些試劑組分中添加了較高濃度的膽酸鹽,膽酸鹽具有膽汁酸