菌種選育理論與技術(shù)

1、關(guān)于菌種選育理論和技術(shù)第一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 微生物分離1.1 菌種分離的一般過程土樣的采取 預(yù)處理 培養(yǎng) 菌落的選擇 產(chǎn)品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題：第二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月1.2 采樣時要注意的問題 氣候、水分、空氣 來源要廣 結(jié)合產(chǎn)品的特點 標(biāo)簽：地點、時間、氣候等第三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 富集的三種方案： 定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集 的條件，進(jìn)行培養(yǎng)。1.3 目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的：讓目的微生物在種

2、群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。 當(dāng)不可能采用定向培養(yǎng)時，則可設(shè)計在一個分 類學(xué)中考慮。 不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息，這 時只能通過隨機分離的辦法。第四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過濾等但主要是通過培養(yǎng)的方法第五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月1.4 菌落的選出 從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素 從形態(tài)的角度 菌落的外觀形態(tài)，

3、是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。第六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月例：醛肟水解酶的篩選 -Journal of biotechnology 94(2002), 65-72培養(yǎng)基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補充新鮮培養(yǎng)基不斷分析樣品，2-3個月后Z-PAOx降低后，稀釋分離單菌落第七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月1.5 目的微生物富集方法的研究進(jìn)展 分子生物學(xué)的實驗手段，在微生物鑒別及特定目標(biāo)產(chǎn)物 的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析

4、及DNA/DNA雜交技術(shù)等 目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數(shù)的1%。微生物的 多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點。 In contrast to this traditional approach, modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to enzymes of nonculturable organisms. By this strategy, for instance, the company Diver

5、sa (San Diego, CA, USA) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.第八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 自然選育 2.1 定義 利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離，篩選排除衰退型菌株，從中選擇維持原有水平的菌株，又稱自然分離。二、菌種退化的原因自發(fā)突變；異核體的存在；突變株不穩(wěn)定第九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月生產(chǎn)菌種斜面制備單孢子懸浮液 分離出單菌落 斜面

6、種子 高產(chǎn)菌株沙土管菌種斜面種子 搖瓶復(fù)篩 高產(chǎn)純化株 生產(chǎn)試驗進(jìn)一步選育或保藏移種搖瓶初篩2.2 自然選育流程圖第十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 誘變育種 3.1 定義 將生物體暴露于物理、化學(xué)或生物誘變劑作用下，促使生物體發(fā)生突變、提高變異幅度，從而選出優(yōu)良菌種的過程。 第十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月穩(wěn)定性試驗、菌種特性考察高產(chǎn)菌株斜面種子 搖瓶復(fù)篩 高產(chǎn)純化株 生產(chǎn)菌種斜面制備單孢子懸浮液 分離出單菌落 斜面種子 誘變處理統(tǒng)計存活率統(tǒng)計變異率3.2 誘變育種流程圖放大、菌種保藏第十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于

7、2022年6月3.3 誘變劑 凡能提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱誘變劑。 3.3.1 物理誘變劑 紫外線、X射線、射線、快中子、離子束 UV：260nm，是堿基共軛體系的最高吸收峰 引起胸腺嘧啶二聚體的形成和胞嘧啶水合作用 生物學(xué)效應(yīng)：DNA鏈的斷裂；DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)；核酸和蛋白的交聯(lián)。 第十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 實驗室：15W，253.7nm，燈管與樣品的距離30cm，劑量由時間（30秒、 60秒、 90秒、 120秒）或能量（格爾）決定。 死亡率控制在7090%。 誘變后注意要避光培養(yǎng)（因為光復(fù)活現(xiàn)象）。 第十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.3.

8、2 化學(xué)誘變劑 烷化劑：如亞硝基胍（NTG）、硫酸二乙酯（DES）、乙烯亞胺（EI）、氮芥 作用機制：使核酸的氮原子上烷基，從而使配對錯誤。堿基類似物：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，2-氨基嘌呤COBr5-BU:酮式COHBr5-BU:烯醇式第十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月移碼誘變劑：丫啶橙、丫啶黃 引起堿基喪失或增加抗癌藥物：絲裂霉素、爭光霉素 抑制DNA復(fù)制3.3.3 生物誘變劑 噬菌體，轉(zhuǎn)座子第十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4 菌種誘變的方法 誘變育種包括出發(fā)菌種選擇、誘變處理和篩選突變株三個部分。 3.4.1

9、出發(fā)菌種選擇原則： 選取純種作為出發(fā)菌株 選擇具有優(yōu)良性狀的菌株 對誘變劑敏感的菌株第十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液：芽孢桿菌應(yīng)處理芽孢放線菌，霉菌應(yīng)處理孢子細(xì)菌指數(shù)期，放線菌、霉菌要稍加萌發(fā)后使用出發(fā)菌株應(yīng)制成均勻懸液第二十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月誘變劑的使用： 劑量以誘變劑濃度和處理時間來表示合適劑量： 能擴大變異幅度又能促使 變異移向正變范圍的劑量 3.4.2 誘變處理還可加誘變增強劑:如LiCl第二十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)兩種或多種誘變劑先后使用同種誘變劑重復(fù)使用兩種或多種誘變劑同時

10、使用第二十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4.3 突變株的選擇3.4.3.1 隨機篩選搖瓶篩選法瓊脂塊篩選法篩選自動化和篩選工具微型化第二十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月一個出發(fā)菌株誘變劑處理選出200個單 孢子菌菌株初篩（每株1瓶）選出50株第一輪第二輪五個出發(fā)菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）誘變劑處理選出5 株40株40株40株40株40株復(fù)篩（每株4瓶）選出5 株高效搖瓶篩選方案第二十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月誘變春日霉素產(chǎn)生菌的孢子懸液含供試菌種（拮抗對象）的瓊脂平板 瓊脂塊培養(yǎng)篩選法 春日霉素高產(chǎn)菌種第二十五張，PPT共六十頁，

11、創(chuàng)作于2022年6月 3.4.3.2 理性化篩選初級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選篩選營養(yǎng)缺陷型若分別篩選、高產(chǎn)菌株，根據(jù)下列代謝途徑，應(yīng)：A B C D EA B C DEF篩選E缺陷型篩選F缺陷型第二十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株 篩選油酸缺陷型或甘油缺陷型 篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 結(jié)構(gòu)類似物一方面與代謝物結(jié)構(gòu)相似，有相似的反饋調(diào)節(jié)作用；一方面不同于代謝物不具有正常的生理功能，使細(xì)胞死亡。 添加此類物質(zhì)，大部分細(xì)胞缺少該種初級代謝物而死亡，生長下來的菌株對此結(jié)構(gòu)類似物不敏感，不受此反饋調(diào)節(jié)抑制。第二十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月HD:高絲氨酸

12、脫氫酶黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)節(jié)機制 HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結(jié)構(gòu)類似物抗性：Lys的類似物AEC,Thr的類似物AHV營養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型第二十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月黃色短桿菌F9-50的誘變譜系 Bervibacterium flavum As 1.495 (Ile-) lys.HCl 2.1 g/lF6-16 (Ile -, Thr -) 20.8 g/lF9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l第二十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變株 先選對產(chǎn)物敏感的菌株，再誘變處理得到恢復(fù)

13、突變株（改變酶的調(diào)節(jié)位點，不受產(chǎn)物的反饋抑制）。第三十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選篩選營養(yǎng)缺陷型篩選負(fù)變株或零變株的回復(fù)突變株篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株 磷酸鹽對許多抗生素的生物合成有抑制作用第三十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月篩選去除碳源分解代謝突變株 能被菌快速利用的碳源在被代謝后，對其他代謝途徑的酶有抑制作用，例葡萄糖效應(yīng)。 葡萄糖效應(yīng)：培養(yǎng)基中同時含有葡萄糖和乳糖，微生物先利用葡萄糖、葡萄糖利用完后才利用乳糖，出現(xiàn)兩次菌體生長旺盛時期，若加入乳糖酶誘導(dǎo)物，也不產(chǎn)生乳糖酶，而是在葡萄糖利用完后才產(chǎn)生。 方法：將菌在含有葡萄糖和以組氨酸為唯一

14、氮源的培養(yǎng)基連續(xù)傳代。篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 許多抗生素和氨基酸有共同的前體第三十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月篩選二價金屬離子抗性突變株 二價金屬離子可與產(chǎn)物或其中間體結(jié)合，抑制產(chǎn)物合成篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 前體或前體結(jié)構(gòu)類似物對菌體的生長和抗生素的生物合成有抑制作用篩選自身所產(chǎn)抗生素抗性突變株第三十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 雜交育種 4.1 定義 將兩個基因型不同的菌株經(jīng)吻合或接合使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。 4.2 舉例 一株大腸桿菌A-B+Lac-SMrT1s 另一株大腸桿菌A+B-Lac+SMsT1r

15、混合培養(yǎng)后，長出少數(shù)菌落。第三十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月4.2.1 細(xì)菌雜交 在細(xì)菌中實現(xiàn)雜交的種類尚不多，主要是大腸桿菌，其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。 大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒有F因子稱F-。整合狀態(tài)為Hfr。 F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。第三十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月4.2.2 酵母雜交育種技術(shù) 酵母繁殖方式： 酵母為單細(xì)胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經(jīng)過特定條件的誘導(dǎo)，可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單

16、倍體繁殖體。 單倍體細(xì)胞具及2兩種交配型。兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配，恢復(fù)為雙倍體；同一交配型細(xì)胞之間，則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配。 在生活過程中，酵母細(xì)胞還可以形成三倍體、四倍體、多倍體或非整倍體細(xì)胞。第三十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 一般而言，雜交育種運用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。 第三十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 原生質(zhì)體技術(shù) 菌體經(jīng)溶菌酶處理后，去掉了細(xì)胞壁，露出球形且特別脆弱的原生質(zhì)體。它對滲透壓、振蕩、離心等十分

17、敏感。 但由于原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)與生理活性均未發(fā)生改變，故在適宜的條件下，可以再生出細(xì)胞壁進(jìn)行細(xì)胞分裂。 第三十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月原生質(zhì)體制備和再生的過程 培養(yǎng)菌絲(細(xì)胞) 洗滌菌絲溶菌酶處理菌絲 形成原生質(zhì)體、離心 用高滲溶液洗滌原生質(zhì)體過濾顯微計數(shù)原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合 原生質(zhì)體再生融合子的選擇第三十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 分子育種6.1 提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量基因工程技術(shù)提高抗生素產(chǎn)量的主要手段1. 增加限速酶的基因拷貝數(shù)2. 增加正調(diào)節(jié)基因,去除負(fù)調(diào)節(jié)基因3. 增加抗性基因的拷貝數(shù)第四十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月6.1.1 增加限

18、速酶的基因拷貝數(shù)原理： Ea Eb Ec Ed A B C D E ( 代謝產(chǎn)物） 限速酶 Rate-limiting enzyme (Bottleneck)例1: 起始原料 Ea Eb Ec -aminoadipic acid ACV三肽 異青霉素N 青霉素 L-cysteine L-valine Ea: ACV合成酶（限速酶） Eb:異青霉素N合成酶 Ec:異青霉素N?；饷?第四十一張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月例2. 頭孢菌素C生物合成的限速酶 在頭孢菌素C 的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，人們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后在得到的發(fā)酵液中，除了主要產(chǎn)物是頭孢菌素C外，在發(fā)酵液中還積累另一種產(chǎn)物-青霉素

19、N。 問題：積累中間產(chǎn)物-青霉素N 原因：下一步反應(yīng)為限速酶反應(yīng) 解決：導(dǎo)入額外的擴環(huán)酶/羥化酶基因 結(jié)果：使頭孢菌素C的產(chǎn)量提高 25-50%， 積累的青霉素N消失。第四十二張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月例3： 十一烷基靈菌紅素 產(chǎn)生菌:天藍(lán)色鏈霉菌 S.colicolorA3(2)acetyl CoA polyketide pathway 氧甲基轉(zhuǎn)移酶S-腺苷甲硫氨酸構(gòu)建重組質(zhì)粒(帶甲氧基轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化到氧甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷變株 轉(zhuǎn)化菌株十一烷基靈菌紅素產(chǎn)量提高5倍第四十三張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月6.1.2 增加正調(diào)節(jié)基因, 去除負(fù)調(diào)節(jié)基因 調(diào)節(jié)基因根據(jù)其作用的不同分為

20、正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)。正調(diào)節(jié)促進(jìn)生物合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，負(fù)調(diào)節(jié)阻扼結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。 第四十四張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月 次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇內(nèi)的正負(fù)調(diào)節(jié)基因 基因 效應(yīng) 菌株 次級代謝產(chǎn)物 功 能 brpA 正 吸水鏈霉菌 Bialaphos 激活bar ( Bialaphos 抗性)基因和 6個bap (生物合成)基因的轉(zhuǎn)錄 tylG 正 弗氏鏈霉菌 泰洛星 激活tyl F( 編碼 MOMT) 和其它 tyl 生物合成基因的表達(dá) actII 正 天藍(lán)色鏈霉菌 放線紫紅素 能使act菌株放線紫紅素的產(chǎn) 量增加30 40倍 mmy 負(fù) 天藍(lán)色鏈霉菌 次甲霉素 該基因的插入失活導(dǎo)致次

21、甲霉 素過量生產(chǎn) strR 正 灰色鏈霉菌 鏈霉素 調(diào)節(jié)鏈霉素的生物合成 . 第四十五張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月去除負(fù)調(diào)節(jié)基因使結(jié)構(gòu)基因超量表達(dá)Methylenomycin（次甲霉素）次甲霉素是由天藍(lán)色鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素，研究結(jié)果表明，次甲霉素是由天藍(lán)色鏈霉菌攜帶的質(zhì)粒SCP I 編碼的。在其生物合成結(jié)構(gòu)基因的上游，存在一個負(fù)調(diào)節(jié)基因-mmy。 克隆到質(zhì)粒上 轉(zhuǎn)化變青鏈霉菌 轉(zhuǎn)化子 （次甲霉素高產(chǎn)表達(dá)）mmy第四十六張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月6.1.3 增加抗性基因的拷貝數(shù) 抗性基因的作用是避免抗生素產(chǎn)生菌被自身產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所殺滅。 其作用可通過三條途徑實現(xiàn)：抗性

22、基因產(chǎn)物(酶)將抗生素作用的底物加以修飾;將抗生素的分子結(jié)構(gòu)加以修飾,使其失活; 將抗生素分子排出細(xì)胞外。 第四十七張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月例1. Davies J. 利用鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702 從卡那霉素產(chǎn)生菌克隆了6-N-氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC6的基因(aacA),該基因產(chǎn)物在乙酰輔酶A的存在下,可將氨基糖苷類抗生素的氨基糖6乙?；acA基因轉(zhuǎn)入新霉素和卡那霉素的產(chǎn)生菌中, 結(jié)果顯著提高了抗生素的產(chǎn)量. 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化子- 鏈霉菌細(xì)胞 氨基糖苷類抗生素產(chǎn)量提高第四十八張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月卡那霉素6-乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC（6） 的作用第四十九張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月例2. 螺旋霉素抗性基因srmB 重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化 S.ambofaciens（生二素鏈霉菌） 轉(zhuǎn)化子 使螺旋霉素產(chǎn)量提高。 第五十張，PPT共六十頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2 改進(jìn)代謝產(chǎn)物的組分 鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物常常是一組結(jié)構(gòu)相似的混合物。每個化合物稱為它的一個組分。多組分產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)是因為次級代謝產(chǎn)物的合成酶對底物的