生物芯片技術(shù)及臨床應(yīng)用和檢查方案

1、生物芯片技術(shù)及臨床應(yīng)用和檢查方案生物芯片的技術(shù)背景與發(fā)展前景12生物芯片技術(shù)在臨床中的應(yīng)用21生物芯片的技術(shù)背景與發(fā)展前景11生物芯片的技術(shù)背景與發(fā)展前景12 一、生物芯片的技術(shù)背景與發(fā)展前景生物芯片技術(shù)是當(dāng)代生物技術(shù)的重大變革 ！ 生物芯片技術(shù)始于20世紀(jì)80年代后期 其概念源于計(jì)算機(jī)芯片 其成熟標(biāo)志為全球掀起的生物芯片產(chǎn)業(yè)化熱潮！生物芯片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域生物芯片疾病診斷疾病防治食品衛(wèi)生藥物篩選司法鑒定國(guó)家安全農(nóng)業(yè)產(chǎn)質(zhì)環(huán)境檢測(cè)隨著后基因組計(jì)劃和生物信息論的發(fā)展，確定了人體功能是許多大分子蛋白、小分子細(xì)胞因子、及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子相互作用、相互調(diào)節(jié)的結(jié)果，疾病也是如此。原有的測(cè)定方法已不能滿足快速處理

2、如此大量的疾病相關(guān)信息的需要，因此人們致力于發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、小型、廉價(jià)的生物檢測(cè)技術(shù)。低密度的蛋白芯片的出現(xiàn)就是針對(duì)這種需求而來(lái)的。蛋白芯片 目前臨床上首先開(kāi)發(fā)的是中低密度蛋白芯片。蛋白芯片嚴(yán)格的說(shuō)仍屬于血清學(xué)方法，但由于生物芯片技術(shù)本身具有的突出優(yōu)點(diǎn)，使此技術(shù)呈現(xiàn)出廣闊的科學(xué)前景和良好的臨床需求。 蛋白芯片微矩陣根據(jù)需要設(shè)計(jì)為不同的樣品，體現(xiàn)芯片的高通量特性。 層析動(dòng)力學(xué)反應(yīng) 芯片 VS ELISA 的優(yōu)勢(shì)多項(xiàng)聯(lián)檢單人份操作操作簡(jiǎn)單工作量少時(shí)間短自帶標(biāo)準(zhǔn)曲線反射光，可減掉背景噪音自動(dòng)化讀數(shù)無(wú)污染一次檢測(cè)一項(xiàng)多人份操作稀釋樣本操作步驟多，耗時(shí)多操作干擾大自定標(biāo)準(zhǔn)值透射光，需要質(zhì)控品對(duì)照人工轉(zhuǎn)化

3、結(jié)果數(shù)據(jù)生物芯片的種類 生物芯片：是一種高度集成的平行化處理生物信息的指甲蓋大小的薄片。 依據(jù)芯片上固定的探針不同，可分為三類。核酸芯片 蛋白芯片組織芯片蛋白芯片與傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法比較 與傳統(tǒng)方法比較具有以下優(yōu)點(diǎn)： 取樣方便、操作簡(jiǎn)單、靈活性高、特異性強(qiáng)、 多指標(biāo)、高通量、時(shí)間短以及立等可取！傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法的顛覆和突破！ 準(zhǔn)確：鏡檢、細(xì)胞培養(yǎng)、PCR、生化熒光、 ELISA、滴金法 早期 快速簡(jiǎn)便 經(jīng)濟(jì)： 性價(jià)比 二、生物芯片技術(shù)在臨床中的應(yīng)用 蛋白芯片臨床應(yīng)用： 幽門螺桿菌抗體譜檢測(cè)芯片 呼吸道病毒感染抗體譜檢測(cè)芯片 幽門螺桿菌HP抗體譜檢測(cè)芯片尿素酶（Ure）IgG細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A（CagA）

4、IgG細(xì)胞空泡毒素A蛋白（VacA）IgG熱休克蛋白60（Hsp60）IgG硝基還原酶(RdxA) IgG幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)寄居在胃幽門附近胃竇黏膜上的革蘭氏陰性桿菌。HP能分泌的尿素酶，分解尿素生成氨和CO2。氨在HP周圍形成“氨云”中和胃酸，對(duì)HP起保護(hù)作用不被胃酸殺滅，HP還能產(chǎn)生熱休克蛋白以保護(hù)自身蛋白不被胃酸破壞。HP產(chǎn)生的各種保護(hù)性酶或蛋白對(duì)胃黏膜造成損害，HP的DNA可整合入宿主DNA引起轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致胃黏膜的癌變。 2005年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了澳大利亞科學(xué)家沃倫和馬歇爾。因?yàn)樗麄儼l(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致胃炎和胃潰瘍的細(xì)菌幽門螺旋桿菌。 該研究使人

5、們認(rèn)識(shí)到胃潰瘍是一種細(xì)菌感染性疾病。而在1982年發(fā)現(xiàn)這種細(xì)菌之前，胃潰瘍的主要引發(fā)原因一直被認(rèn)為是生活壓力和生活習(xí)慣。事實(shí)上，90%的十二指腸潰瘍和80%的胃潰瘍都是由幽門螺旋桿菌引起的。HP的生物學(xué)特性HP 菌株毒力不同?？舍尫趴张荻舅兀╒acA）和細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A（CagA）的菌株，這種HP被稱為產(chǎn)毒型HP。致病力更強(qiáng)!HP與疾病的關(guān)系幽門螺桿菌是慢性活動(dòng)性胃炎的主要原因，是慢性萎縮性胃炎和胃潰瘍的重要元兇，與胃癌發(fā)生關(guān)系密切，已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為胃癌的第一類致癌因子。近年研究表明，幽門螺桿菌還是心血管疾病、糖尿病等疾病的致病因子。 HP流行病學(xué)調(diào)查表明，世界上一半以上成年人

6、的胃內(nèi)有此菌，發(fā)展中國(guó)家高于發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)HP感染率高達(dá)80%。兒童期感染危險(xiǎn)性很大。10歲齡感染率40-60%。HP感染越早，患胃癌的可能性越大，凡是兒童HP感染率高的地區(qū)成人胃癌發(fā)病率也高。 據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，浙江地區(qū)幽門螺桿菌感染率為74%。近年來(lái)，兒科門診發(fā)現(xiàn)不少兒童患慢性胃炎的病例，往往由于被媽媽認(rèn)為肚里有寄生蟲(chóng)而耽誤了治療。兒童患慢性胃炎有逐年增多的趨勢(shì)，尤其是36歲的學(xué)齡前兒童。針對(duì)兒童及家庭預(yù)防和根治幽門螺桿菌感染不僅對(duì)胃部疾病而且對(duì)胃部以外的疾病的預(yù)防和治療有非常重要的意義。醫(yī)學(xué)專家認(rèn)為對(duì)幽門螺桿菌感染的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療是防治慢性萎縮性胃炎、胃癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)！第三次全國(guó)幽門螺桿

7、菌感染若干問(wèn)題共識(shí)報(bào)告(2007.8廬山會(huì)議)Hp感染的診斷方法侵入性方法，依賴于胃鏡活檢。 快速尿素酶試驗(yàn)(RUT)、直接涂片染色鏡檢、組織切片染色鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、基因檢測(cè)方法(如PCR、寡核苷酸探針雜交等)、免疫檢測(cè)尿素酶 (IRUT)。 內(nèi)鏡與活檢鉗消毒不嚴(yán)格可造成醫(yī)源感染。非侵入性檢測(cè)方法，不依賴內(nèi)鏡檢查。 13C或14C尿素呼氣試驗(yàn)(UBT)、15尿氨排泄試驗(yàn)、糞便HP抗原檢測(cè)、血清及分泌物抗體檢測(cè)以及基因芯片和蛋白芯片檢測(cè)等。病人依從性較好。第三次全國(guó)幽門螺桿菌感染若干問(wèn)題共識(shí)報(bào)告(2007.8廬山會(huì)議)HP感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)以下方法檢查結(jié)果陽(yáng)性者可診斷HP現(xiàn)癥感染： 胃黏膜組織RUT

8、、組織切片染色、HP培養(yǎng)三項(xiàng)中任一項(xiàng)陽(yáng)性； 13C-或14C-UBT陽(yáng)性； HPSA檢測(cè)(單克隆法)陽(yáng)性； 血清HP抗體檢測(cè)陽(yáng)性提示曾經(jīng)感染(HP根除后，抗體滴度在5至6個(gè)月后降至正常)，從未治療者可視為現(xiàn)癥感染，須進(jìn)行治療，因HP不會(huì)自然消失。 組織細(xì)胞學(xué)：光鏡法、電鏡法 微生物學(xué)：快速尿素酶試驗(yàn)、分離培養(yǎng) 同位素跟蹤：呼氣試驗(yàn)（碳13、碳14 ） 血清學(xué)：抗體檢測(cè) 分子生物學(xué)：PCR 生物芯片技術(shù)：蛋白芯片HP診斷方法生物芯片技術(shù)：蛋白芯片 優(yōu)點(diǎn)：低創(chuàng)傷、適應(yīng)群體廣范 特異性、靈敏性好 高通量、多指標(biāo) 微型化和自動(dòng)化。 缺點(diǎn)：除菌治療后，陽(yáng)性結(jié)果會(huì)持續(xù)一段時(shí)間。 建議復(fù)查時(shí)結(jié)合其他檢測(cè)手段

9、! HP診斷新方法-蛋白芯片幽門螺桿菌抗體譜芯片檢測(cè) 200ul血清、同時(shí)檢測(cè)5項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)項(xiàng)目臨 床 意 義CagA-IgG陽(yáng)性提示感染HP CagA+毒力株，致病力較強(qiáng)，需治療。VacA-IgG陽(yáng)性提示感染HP VacA+毒力株，致病力較強(qiáng)，需治療。Ure-IgG陽(yáng)性提示感染HP。Hsp60-IgG陽(yáng)性與胃炎的嚴(yán)重程度及胃癌發(fā)生關(guān)系密切，需治療。RdxA-IgG陽(yáng)性提示HP對(duì)甲硝唑類藥物敏感。流行病學(xué)調(diào)查顯示，約40%的感染者體內(nèi)HP并不致病，無(wú)需治療?，F(xiàn)有檢測(cè)方法如培養(yǎng)、快速尿素酶試驗(yàn)、呼氣試驗(yàn)、PCR等只能查有無(wú)HP感染，而是否致病無(wú)法判斷，臨床意義不大。Hp的耐藥性是HP根除治療失敗的

10、主要原因。據(jù)報(bào)道，經(jīng)典治療藥物的耐藥率平均達(dá)50%以上，建議通過(guò)耐藥檢測(cè)才能確保治療效果。研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者中Hsp60抗體陽(yáng)性率超過(guò)70%，提示Hsp60與癌癥胃癌密切相關(guān)。HP芯片檢測(cè)臨床意義HP芯片檢測(cè)臨床意義1、有利于對(duì)于門診常規(guī)檢測(cè)(UBT或RUT)陽(yáng)性病人進(jìn)行分流，并非HP毒力株、且臨床癥狀不明顯者無(wú)需治療；2、判斷是否使用甲硝唑類藥物進(jìn)行HP根除治療，使用何種治療方案；3、判斷胃部病變的嚴(yán)重程度和預(yù)后；4、流行病學(xué)調(diào)查首選方法。HP感染后治療 最常用的根除HP三聯(lián)療法蘭索拉唑+克拉霉素+甲硝唑蘭索拉唑+克拉霉素+阿莫西林呼吸道病毒感染抗體譜檢測(cè)芯片 肺炎支原體（MP）IgM 肺炎衣

11、原體（CP）IgM 合胞病毒（RSV）IgM 腺病毒（ADV）IgM 流行性感冒病毒（IV）IgM 副流感病毒（PIV）IgM呼吸系統(tǒng)疾病為臨床常見(jiàn)病，人群普遍易感，冬、春季為多發(fā)季節(jié)。嬰幼兒、老年人及免疫力低下者容易感染并具更大危險(xiǎn)性。急性呼吸道感染，是小兒時(shí)期最常見(jiàn)的疾病之一，發(fā)病率高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，急性呼吸道感染約占兒科門診患兒60%以上，肺炎占住院患兒1/3以上，且病情嚴(yán)重，死亡率高。我國(guó)12省市小兒死亡原因的回顧調(diào)查表明：5歲以內(nèi)死亡原因中以肺炎占首位，嚴(yán)重威脅小兒生命及健康成長(zhǎng)。呼吸系統(tǒng)疾病肺炎和流感導(dǎo)致的死亡美國(guó)CDC統(tǒng)計(jì)的肺炎和流感導(dǎo)致的死亡比例近幾年國(guó)內(nèi)流行性報(bào)道武漢大學(xué)中南醫(yī)院報(bào)

12、道，2008年5月至2009年4月間因呼吸道疾病住院的兒童中感染率最高的為甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒和肺炎支原體 （Peng D. et al. Vorol J 2009; 6: 155)廣東CDC報(bào)道，2006至2009年感染呼吸道的病毒依次為呼吸道合胞病毒、鼻病毒、甲型流感病毒、偏肺病毒、乙型流感病毒、副流感病毒和腺病毒（Zou LR等，中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志 2011；45:825-829）“感染”是呼吸道系統(tǒng)疾病最常見(jiàn)的病因。病原體包括病毒、細(xì)菌、真菌、支原體等。呼吸道病毒一詞并非是病毒分類學(xué)上的名稱，而是指主要以呼吸道為侵入門戶，首先在呼吸道粘膜上皮細(xì)胞中增殖引起呼吸道以及全身感染

13、，造成呼吸道及其他器官損害的病原體的總稱。臨床上的急性呼吸道感染中有90-95%由以上病原體引起。 呼吸道感染的主要病原體 引起呼吸道感染的病原體很多，主要病原體依次為：呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、副流感病毒、肺炎衣原體和肺炎支原體一般引起流感樣癥狀：發(fā)熱（體溫高于37.8，舌下溫度）咳嗽和/或喉嚨腫痛重癥者可發(fā)展為肺炎乃至死亡不同地區(qū)引起呼吸道感染的病原體可能不同，但目前缺乏不同地區(qū)之間的比較研究同一地區(qū)不同時(shí)間引起呼吸道感染的主要病原體也不相同，需要及時(shí)監(jiān)測(cè)病原體的流行情況鑒于目前合理應(yīng)用抗生素的要求以及CRP、PCT等項(xiàng)目的廣泛，區(qū)別病毒感染和非病毒感染已經(jīng)不再是難題，而進(jìn)一步確定

14、病毒種類有助于臨床對(duì)癥治療，因此需要對(duì)感染呼吸道的主要病毒進(jìn)行一進(jìn)步檢測(cè)和鑒定關(guān)注呼吸道病毒呼吸道感染常用檢查方法：類別呼吸道病原體常用檢查方法病毒類呼吸道合胞病毒 1、分離與鑒定； 2、抗原檢測(cè)：免疫熒光； 3、血清學(xué)檢測(cè)特異性抗體腺病毒流感病毒副流感病毒衣原體類肺炎衣原體支原體類肺炎支原體呼吸道病毒感染抗體譜檢測(cè)芯片（100ul血清，同時(shí)檢測(cè)六項(xiàng)指標(biāo)） 肺炎衣原體(CP) IgM 肺炎支原體(MP ) IgM 合胞病毒(RSV) IgM 腺病毒(ADV) IgM 流感病毒(IV) IgM 副流感病毒(PIV) IgM為什么要早期診斷？1、治療針對(duì)性強(qiáng)診斷舉例： 病毒感染：血常規(guī)正常，呼吸道

15、六聯(lián)中支原體和衣原體全陰?？共《局委?。 細(xì)菌感染：血常規(guī)增高，呼吸道六聯(lián)全陰?？咕委煛?支原體和衣原體感染：血常規(guī)一般正常，支原體或衣原體陽(yáng)性。針對(duì)性治療。2、治療有時(shí)效性大部分呼吸道病毒越早治療效果越好。比如，在出現(xiàn)流感癥狀的48小時(shí)內(nèi)使用奧司他韋效果最好，過(guò)了這個(gè)時(shí)間段后療效甚微。它主要通過(guò)干擾病毒從被感染的宿主細(xì)胞中釋放，從而減少甲型或乙型流感病毒的傳播。這在2011版流感診療指南中也有明確提到。3、避免抗生素的濫用準(zhǔn)確的診斷能幫助醫(yī)生確定是否使用抗生素來(lái)治療病人。濫用抗生素危害很多，最主要的是細(xì)菌耐藥性問(wèn)題。世界上已出現(xiàn)多種“超級(jí)細(xì)菌”，它們對(duì)許多抗生素耐藥。同時(shí)，濫用抗生素還會(huì)導(dǎo)致隱形傷亡，對(duì)肌體和體質(zhì)造成長(zhǎng)遠(yuǎn)損