卵形鯧JunB基因克隆及其胚胎組織表達(dá)分析

1、 卵形鯧JunB基因克隆及其胚胎組織表達(dá)分析 潘傳燕 余艷玲 羅洪林 馮鵬霏 宋漫玲 肖蕊 張永德卵形鯧JunB基因克隆及其胚胎組織表達(dá)分析潘傳燕，余艷玲，羅洪林，馮鵬霏，宋漫玲，肖 蕊，張永德*（廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）Summary：【目的】明確卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）JunB基因（ToJunB）在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，為揭示JunB基因在魚類胚胎發(fā)育過程中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎肦T-PCR擴(kuò)增ToJunB基因編碼區(qū)（CDS）序列，通過ProtParam、NetSurfP 2.0、TMHMM、Sig

2、nalP、PSORT及NetNGlyc 1.0等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并采用熒光定量PCR檢測(cè)ToJunB基因在卵形鯧鲹17個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期（受精卵、2-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期、16-細(xì)胞期、32-細(xì)胞期、64-細(xì)胞期、多細(xì)胞期、高囊胚期、原腸早期、原腸中期、原腸末期、胚胎形成期、眼囊期、耳囊期、心臟跳動(dòng)期、晶體出現(xiàn)期和初孵仔期）的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】克隆獲得的ToJunB基因（1777 bp）包含344 bp的5端非編碼區(qū)（5-UTR）、954 bp的開放閱讀框（ORF）及479 bp的3端非編碼區(qū)（3-UTR），共編碼318個(gè)氨基酸殘基;其編碼蛋白分子量為35.03 kD，理論等電點(diǎn)（pI）

3、為8.26，呈堿性;總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.567，為親水性蛋白。ToJunB蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，主要定位于細(xì)胞核，屬于非分泌型蛋白，在第39、129和168位氨基酸處各存在1個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn);其二級(jí)結(jié)構(gòu)中-螺旋占35.67%、延伸鏈占14.33%、無規(guī)則卷曲占50.00%?；贘unB氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，卵形鯧鲹與黃尾鰤的遺傳距離最近，均隸屬于鱸形目鲹科。ToJunB基因在胚胎發(fā)育前期（受精卵至原腸早期）的相對(duì)表達(dá)量較高，至原腸中期達(dá)最高值，在胚胎發(fā)育后期（原腸末期至初孵仔期）的相對(duì)表達(dá)量均較低，且ToJunB基因在受精卵至原腸中期共10個(gè)發(fā)育時(shí)期的相

4、對(duì)表達(dá)量極顯著高于胚胎發(fā)育后期的7個(gè)時(shí)期（P0.01）?！窘Y(jié)論】ToJunB基因在卵形鯧鲹胚胎受精卵至原腸早期的相對(duì)表達(dá)量較高，于原腸中期達(dá)最高值后迅速降低，原腸末期至初孵仔期的相對(duì)表達(dá)量均較低，說明JunB基因在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育的細(xì)胞分裂和增殖過程中發(fā)揮重要作用。Key： 卵形鯧鯵;JunB基因;胚胎發(fā)育;生物信息學(xué)分析;表達(dá)規(guī)律： S965.331 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ：2095-1191（2021）11-3102-09Cloning of JunB gene in Trachinotus ovatus and itsexpression in embryonic tissuesPAN Ch

5、uan-yan， YU Yan-ling， LUO Hong-lin， FENG Peng-fei，SONG Man-ling， XIAO Rui， ZHANG Yong-de*（Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding andHealthy Aquaculture， Nanning 530021， China）Abstract：【Objective】To explore the expression pattern of Trachinotus ovatus J

6、unB gene（ToJunB） in embryonic development， and lay a foundation for exploring the mechanism of JunB on embryonic development process. 【Method】RT-PCR was used to amplify the encoding region（CDS） sequence of the ToJunB gene， and the bioinformatics analysis was carried out with online softwares such as

7、 ProtParam， NetSurfP 2.0， TMHMM， SignalP， PSORT and NetNGlyc 1.0. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of ToJunB mRNA in 17 bryonic development stages of T. ovatus（zygote， 2-cell embryo， 8-cell embryo， 16-cell embryo， 32-cell embryo， 64-cell embryo， multicellular

8、 stage， blastula stage， early gastrula stage，gastrula stage， late gastrula stage，embryo formed stage， optic vesicle stage， otocyst vesicle stage， heart pulsation stage， formation of eye lens and hatching stage）. 【Result】The ToJunB gene cloned from embryonic tissues of T. ovatus was 1777 bp in length

9、， consisted of 344 bp 5 end non-coding region（5-UTR）， 954 bp open reading frame（ORF） and 479 bp 3 end non-coding region（3-UTR）， encoding 318 amino acid residues， its protein molecular weight was 35.03 kD， theoretical isoelectric point（pI） was 8.26， it was alkaline. The total ave-rage hydrophobic ind

10、ex（GRAVY） was -0.567， indicating that it belonged to hydrophilic protein. ToJunB protein had no transmembrane structure， no signal peptide sequence， and a potential glycosylation site at amino acid 39， 129， 168. The ToJunB protein mainly existed in the nucleus， belonging to asecretory protein. In th

11、e secondary structure，- helix and extended strand accounted for 35.67% and 14.33%，random coil accounted for 50.00%. The phylogenetic trees based on amino acid sequence similarity of JunB indicated that the closest genetic distance with T. ovatus and Serio lalalandi dorsalis. They both were Hericidae

12、，Perciformes. The relative expression of ToJunB gene was higher in the early stage of embryonic development（from the zygote to the early gastrula stage）， reached the highest value in the gastrula stage， and kept low value in the late stage of embryonic development（from the late gastrula stage to the

13、 hatching stage）. The expression level of ToJunB gene in the 10 developmental stages from zygote to early gastrula was extremely significantly higher than that from the late gastrula to the early hatching stage（PKey words： Trachinotus ovatus; JunB gene; embryonic development; boinformatics analysis;

14、 expression patternFoundation item：Innovation Driven Development Project of Guangxi（Guike AA17204080-3，Guike AA18242031-2）; Independent Project of Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture（19-A-01-05）0 引言【研究意義】激活蛋白-1（Activator protein 1，AP-1）家族成員包括兩大類蛋白轉(zhuǎn)錄因子（Jun和Fos），

15、其中Jun基因家族包含c-jun、JunB及JunD等多個(gè)成員。JunB基因位于19號(hào)染色體的p13.2，全長1820 bp，編碼39 kD的DNA結(jié)合蛋白（由347個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成），能與任意的AP-l家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成同源或異源二聚體（楊霞，2009）。JunB基因與c-jun基因的結(jié)構(gòu)相類似，二者具有相互拮抗的作用。JunB基因在含有多個(gè)AP-1位點(diǎn)的啟動(dòng)子中以一種不依賴c-jun基因的方式對(duì)其靶基因進(jìn)行調(diào)控，通過與定位于目標(biāo)基因順式調(diào)控域的認(rèn)知結(jié)合序列結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡等生物學(xué)過程（郭崟等，2018），在腫瘤形成或抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面發(fā)揮重要作用。JunB基因可通過降

16、低Cyclin A表達(dá)、抑制AP-1活性、延長G1期及下調(diào)周期蛋白D1等機(jī)制調(diào)控細(xì)胞周期（楊霞，2009）。因此，克隆JunB基因并研究其在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，對(duì)進(jìn)一步揭示JunB基因的功能及作用機(jī)制具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】JunB基因過量表達(dá)可抑制惡性小鼠角化細(xì)胞增殖，也可促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞侵襲、遷移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（Gurzov et al.，2008）。也有報(bào)道指出，JunB基因在肝細(xì)胞癌變中呈上調(diào)表達(dá)，因此可作為肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)生發(fā)展的潛在標(biāo)志物（張彧等，2013）。JunB基因還可通過激活周期蛋白依賴性激酶（Cycli

17、n-dependent kinases，CDK）抑制物p16，抑制細(xì)胞增殖，故被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，且已有研究證實(shí)JunB基因在肝細(xì)胞癌、乳腺癌及腎細(xì)胞癌中的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)（Koo et al.，1992;Chang et al.，2005;Langer et al.，2006）。此外，Mao等（2003）推測(cè)JunB基因在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用;張彧（2014）研究表明，JunB基因可通過激活Cyclin A轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的生長;徐暢等（2015）研究發(fā)現(xiàn)JunB基因通過抑制釉質(zhì)蛋白的分泌而促進(jìn)釉質(zhì)發(fā)育成熟。JunB基因在不同微環(huán)境中具有不同的作用模式與功能

18、，可抑制B細(xì)胞的增殖和分化（Szremska et al.，2003），或通過上調(diào)IL-4促進(jìn)Th2細(xì)胞分化（孔蘊(yùn)毅，2008），還可通過誘導(dǎo)p16高表達(dá)及下調(diào)Cyclin D等途徑調(diào)控細(xì)胞生長周期（Mao et al.，2003）。當(dāng)機(jī)體受到血清、生長因子及輻射等刺激時(shí)均可誘導(dǎo)JunB基因迅速表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖甚至癌變（de Groot et al.，1991;冉丕鑫和鐘南山，1996;歐陽能太等，1997）。JunB基因在人類疾病主要是癌癥中的作用功能研究較多，而在魚類生長發(fā)育等方面的研究至今未見相關(guān)報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）又稱黃臘鯧、金鯧

19、魚，為廣鹽暖水性中上層魚類，因其生長速度快、肉質(zhì)細(xì)嫩、無刺、味道鮮美，且營養(yǎng)價(jià)值高，作為名貴食用魚類在我國南部沿海地區(qū)的人工養(yǎng)殖得到迅速發(fā)展（張永德等，2020）。近年來，針對(duì)卵形鯧鲹的研究主要集中在生長發(fā)育（黃小林等，2018;Liu et al.，2019）、病害防控與免疫（熊向英等，2018;Sun et al.，2019）、飼料營養(yǎng)（胡海濱等，2019;You et al.，2019）及分子生物學(xué)（Wu et al.，2019;Sun et al.，2020）等方面，而有關(guān)卵形鯧鲹胚胎發(fā)育的研究較少，對(duì)卵形鯧鲹JunB基因（ToJunB）在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)模式及其作用機(jī)制尚未明確。

20、【擬解決的關(guān)鍵問題】以卵形鯧鲹為研究對(duì)象，探究ToJunB基因在17個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，明確卵形鯧鲹胚胎發(fā)育中ToJunB基因的表達(dá)規(guī)律，為揭示JunB基因在魚類胚胎發(fā)育過程中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。1 材料與方法1. 1 試驗(yàn)材料從深圳市南澳鎮(zhèn)大鵬灣海域人工養(yǎng)殖群體中選取性成熟的健康卵形鯧鲹，體重6.27.8 kg，經(jīng)人工催產(chǎn)后自然交配繁殖。待其自然產(chǎn)卵受精后，置于1000 L孵化桶進(jìn)行孵化。顯微鏡下觀察確定胚胎發(fā)育階段，并收集從受精卵至仔魚孵化共17個(gè)時(shí)期（受精卵、2-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期、16-細(xì)胞期、32-細(xì)胞期、64-細(xì)胞期、多細(xì)胞期、高囊胚期、原腸早期、原腸中期、原腸末期、胚胎形成

21、期、眼囊期、耳囊期、心臟跳動(dòng)期、晶體出現(xiàn)期和初孵仔期）的樣品，液氮速凍保存?zhèn)溆?。RNAsimple提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，HiScript? III RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Mix熒光定量試劑盒及AceTaq? Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。ABI 7500 Fast qPCR儀購自美國Thermo Fisher公司，PCR儀購自德國Biometra公司。1. 2 總RNA提取及cDNA合成從液氮盒取出適量凍存組織樣品，經(jīng)研磨棒充分磨碎后按RNAsimple提取試劑盒說明提取卵形鯧鲹不

22、同發(fā)育階段的胚胎組織總RNA。采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，以NanoDrop One檢測(cè)其濃度。對(duì)完整性較好的RNA，根據(jù)HiScript? III RT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。1. 3 ToJunB基因克隆根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的ToJunB基因序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物（表1），預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為1777 bp。以合成的cDNA為模板對(duì)ToJunB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 預(yù)變性3 min;95 30 s，59 30 s，72 90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2.0

23、%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，切膠回收目的條帶并送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。1. 4 ToJunB基因生物信息學(xué)分析經(jīng)測(cè)序及序列核對(duì)后，利用NCBI ORFfinder（https：/orffinder）進(jìn)行開放閱讀框（ORF）及推導(dǎo)氨基酸預(yù)測(cè)分析，采用ProtParam（https：/protparam/）分析其編碼蛋白基本理化性質(zhì)，運(yùn)用NetSurfP 2.0（https：/services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetSurfP-2.0）和Phyre2（http：/www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cg

24、i？id=index）分別預(yù)測(cè)ToJunB蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，并以SAVES 6.0（https：/）對(duì)預(yù)測(cè)的模型進(jìn)行評(píng)估;ToJunB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)采用TMHMM（https：/services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進(jìn)行預(yù)測(cè)，信號(hào)肽利用SignalP（https：/services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，亞細(xì)胞定位運(yùn)用PSORT（http：/psort1.hgc.jp/form.html）進(jìn)行預(yù)測(cè)，糖基化位點(diǎn)則以NetNGlyc 1.0（https：/servic

25、es.healthtech.dtu.dk/service.php？NetNGlyc-1.0）進(jìn)行預(yù)測(cè)。1. 5 ToJunB基因序列同源分析采用MEGA X將ToJunB基因序列與31個(gè)已知物種的JunB基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，包含魚類、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、哺乳動(dòng)物及人類（表2），計(jì)算其遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并選用Jones-Taylor-Thornton（JTT）模型，對(duì)空位采用完全刪除，設(shè)Bootstrap為1000次。1. 6 卵形鯧鲹胚胎組織ToJunB基因表達(dá)定量分析以卵形鯧鲹不同發(fā)育期的胚胎組織cDNA為模板、18S為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ToJunB基因在卵形

26、鯧鲹17個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系16.0 L：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 8.0 L，上、下游引物（10 mol/L）各0.32 L，cDNA模板1.6 L，DEPC水補(bǔ)足至16.0 L。ToJunB基因相對(duì)表達(dá)量采用2-?Ct法進(jìn)行換算，并以SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。2 結(jié)果與分析2. 1 ToJunB基因克隆及序列測(cè)定結(jié)果PCR擴(kuò)增獲得1條長度約1800 bp的目的基因片段，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，確定該片段即為ToJunB基因（1777 bp），包含344 bp的5端非編碼

27、區(qū)（5-UTR）、954 bp的ORF及479 bp的3端非編碼區(qū)（3-UTR），共編碼318個(gè)氨基酸殘基（圖1），其中強(qiáng)堿性氨基酸殘基34個(gè)、強(qiáng)酸性氨基酸殘基32個(gè)、疏水氨基酸殘基91個(gè)、極性氨基酸殘基101個(gè)?；蛐蛄薪M成分析發(fā)現(xiàn)，堿基A、C、G、T含量分別為26.34%（468個(gè)）、26.34%（468個(gè)）、25.27%（449個(gè)）和22.06%（392個(gè)），且G+C含量（51.60%）高于A+T含量（48.40%），說明ToJunB基因序列DNA雙鏈結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。2. 2 ToJunB蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果采用ProtParam分析ToJunB蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白編碼氨基酸殘基數(shù)為

28、318個(gè)，分子量為35.03 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.26;帶負(fù)電氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）32個(gè)，帶正電氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）34個(gè);不穩(wěn)定指數(shù)為49.66，表明該蛋白穩(wěn)定性較差;脂溶指數(shù)為73.68，總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.567（圖2），說明ToJunB蛋白為親水性蛋白。2. 3 ToJunB蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果通過TMHMM對(duì)ToJunB蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示，ToJunB蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，318個(gè)氨基酸殘基均處于細(xì)胞膜外，在胞外發(fā)揮作用，有效減少跨膜區(qū)疏水性氨基酸對(duì)蛋白折疊的影響，更有利于原核表達(dá)及純化。2. 4 ToJunB蛋白信

29、號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果信號(hào)肽在引導(dǎo)外源蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用，使用SignalP進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖4）表明在ToJunB蛋白氨基酸序列中未檢測(cè)到信號(hào)肽，即該蛋白屬于非分泌型蛋白。2. 5 ToJunB蛋白亞細(xì)胞定位及糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果利用PSORT對(duì)ToJunB蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示，細(xì)胞核為0.940，微體（過氧化物酶體）為0.300，線粒體基質(zhì)空間為0.100，溶酶體（管腔）為0.100，表明ToJunB蛋白主要存在于細(xì)胞核，其次是微體（過氧化物酶體），少量分布在線粒體基質(zhì)和溶酶體內(nèi)。ToJunB蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，在第39、129和168位氨基酸處各存在1個(gè)潛在

30、的糖基化位點(diǎn)。2. 6 ToJunB蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果利用NetSurfP對(duì)ToJunB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)ToJunB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由-螺旋、延伸鏈及無規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中-螺旋占35.67%、延伸鏈占14.33%、無規(guī)則卷曲占50.00%（圖6）。利用同源建模對(duì)ToJunB蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，同源建模的模板序列與ToJunB氨基酸序列的一致度為68%，模型可信度為98.5%，其主體結(jié)構(gòu)為一段柱狀的雙螺旋結(jié)構(gòu)（圖7），其余為無規(guī)則結(jié)構(gòu)。采用SAVES在線程序?qū)?gòu)建的模型進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示，ERRAT質(zhì)量評(píng)分為100，Procheck 8項(xiàng)評(píng)估中通過7項(xiàng)、警告1項(xiàng)，無錯(cuò)誤項(xiàng)，說明構(gòu)建

31、的模型可靠性較高。2. 7 ToJunB氨基酸序列同源比對(duì)分析結(jié)果以ToJunB氨基酸序列與GenBank已公布其他物種的JunB氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，并基于JunB氨基酸序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖8）顯示，32個(gè)物種聚類成兩大分支，魚類為一支，另一支為爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物及人類。在魚類分支中，卵形鯧鲹和黃尾鰤（S. lalandi dorsalis）同屬于鱸形目（Perciformes）鲹科（Carangidae），其遺傳距離最近;其次與鳉形目（Cyprinodontiformes）和鯉形目（Cypriniformes）魚類也具有較近的親緣關(guān)系。2. 8 ToJun

32、B基因在卵形鯧鲹不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ToJunB基因在卵形鯧鲹17個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，結(jié)果如圖9所示。ToJunB基因在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)情況表現(xiàn)為：發(fā)育前期（受精卵至原腸早期）的相對(duì)表達(dá)量較高，于原腸中期達(dá)最高值后迅速降低，發(fā)育后期（原腸末期至初孵仔期）的相對(duì)表達(dá)量均較低。其中，ToJunB基因在受精卵至原腸中期共10個(gè)發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于胚胎發(fā)育后期的7個(gè)時(shí)期（原腸末期至初孵仔期）（P0.01）。3 討論JunB基因是Jun基因家族的成員之一，是構(gòu)成AP-1的重要亞基，其主要功能作用是參與調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程及編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白等（王磊等，

33、2010）。早在1998年，Kr?mer等就篩選出JunB基因，并指出JunB基因是低氧耐受候選基因。至今，關(guān)于JunB基因的研究主要集中在人類疾病（腫瘤）的發(fā)生發(fā)展過程方面。楊霞（2009）研究發(fā)現(xiàn)，JunB基因能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，可抑制胃癌細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移，在腎細(xì)胞癌（Koo et al.，1992）、肝細(xì)胞癌（Chang et al.，2005）及乳腺癌（Langer et al.，2006）的研究中也有類似結(jié)論。張彧（2014）研究表明，JunB基因在肝癌組外周血的相對(duì)表達(dá)量均高于其他組，可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，提示其可作為肝細(xì)胞癌預(yù)警標(biāo)志物。此外，JunB基因在牙釉質(zhì)形成分泌期和

34、釉質(zhì)成熟期也發(fā)揮重要作用（Nishikawa，2000）。胚胎發(fā)育是動(dòng)物機(jī)體生長發(fā)育的基礎(chǔ)，是一項(xiàng)龐大的系統(tǒng)工程，由多個(gè)基因共同發(fā)揮作用完成。哺乳動(dòng)物只有1個(gè)JunB基因，在胚胎血管網(wǎng)絡(luò)的形成過程中發(fā)揮重要作用，主要是作為新型的血管生成調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)血管的形成及發(fā)育（Yoshitomi et al.，2017）。JunB被證明是血管發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵正調(diào)節(jié)劑，也是炎癥反應(yīng)和腫瘤生長的負(fù)調(diào)節(jié)劑，因此被稱為具有正負(fù)調(diào)控功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（Hess et al.，2004;Pflegerl et al.，2009）。在水產(chǎn)動(dòng)物方面，JunB基因作為調(diào)節(jié)斑馬魚淋巴管生成的轉(zhuǎn)錄因子，是通過miR-182控

35、制斑馬魚淋巴血管的發(fā)育（Kiesow et al.，2015）;JunB基因在非洲爪蟾早期胚胎發(fā)生期間還參與尾巴的形成（Yoshida et al.，2016）。本研究結(jié)果表明，ToJunB基因ORF為954 bp，共編碼318個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為35.03 kD，pI為8.26，屬于堿性蛋白，穩(wěn)定性較差;ToJunB蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，318個(gè)氨基酸殘基均處于細(xì)胞膜外，也不存在信號(hào)肽;ToJunB蛋白主要存在于細(xì)胞核，其次是微體（過氧化物酶體）;存在3個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn);其二級(jí)結(jié)構(gòu)由-螺旋（占35.67%）、延伸鏈（占14.33%）及無規(guī)則卷曲（占50.00%）構(gòu)成?；贘unB

36、氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，卵形鯧鲹與黃尾鰤的遺傳距離最近，均隸屬于鱸形目鲹科，與其傳統(tǒng)分類結(jié)果一致。為了解ToJunB基因在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，本研究收集受精卵至仔魚孵化共17個(gè)時(shí)期的樣品，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示：ToJunB基因在胚胎發(fā)育前期（受精卵至原腸早期）的相對(duì)表達(dá)量較高，至原腸中期達(dá)最高值，在胚胎發(fā)育后期（原腸末期至初孵仔期）的相對(duì)表達(dá)量均較低，且ToJunB基因在受精卵至原腸中期共10個(gè)發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于胚胎發(fā)育后期的7個(gè)時(shí)期（原腸末期至初孵仔期）?？梢?，ToJunB基因在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育的細(xì)胞分裂和增殖過程中發(fā)揮重

37、要作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。4 結(jié)論ToJunB基因在卵形鯧鲹胚胎受精卵至原腸早期的相對(duì)表達(dá)量較高，于原腸中期達(dá)最高值后迅速降低，原腸末期至初孵仔期的相對(duì)表達(dá)量均較低，說明JunB基因在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育的細(xì)胞分裂和增殖過程中發(fā)揮重要作用。參考文獻(xiàn)：郭崟，訾龍，谷泉，徐振明. 2018. JunB基因在先天性小耳畸形中的表達(dá)及臨床意義J. 中國優(yōu)生與遺傳雜志，26（12）：89-91. Guo Y，Zi L，Gu Q，Xu Z M. 2018. Expression and clinical significance of JunB gene in congenital microtia

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