細(xì)胞工程要點(diǎn)、思考題、補(bǔ)充題詳解

1、細(xì)胞工程各章節(jié)小結(jié)、課后思考題及補(bǔ)充思考題第一章緒論小結(jié)：一、生物工程定義：一般稱為生物技術(shù)，是以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體系和工程學(xué)原理生產(chǎn)生物制品和創(chuàng)造新品種的一門綜合技術(shù)。二、細(xì)胞工程定義：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，通過類似于工程學(xué)的步驟，在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水品上，按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)以獲得新型生物或特種細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。重要應(yīng)用：（1）動植物快速繁殖； （2）品種改良與新品種培育； （3）細(xì)胞工程生物制品； （4）組織工程； （5）動物胚胎工程快速繁殖優(yōu)良、瀕危品種； （6）醫(yī)學(xué)器官修復(fù)或移植的組織工程； （7）用于能源開發(fā)、環(huán)保； （8）轉(zhuǎn)基因

2、動植物的生物反應(yīng)器工程；第二章細(xì)胞工程基礎(chǔ)小結(jié)：一、細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)細(xì)胞分化：是指細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程，包括時間上和空間上的分化。細(xì)胞全能性：是指分化細(xì)胞保留著全部的核基因組，具有生物個體生長、發(fā)育所需要的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整個體的潛能。二、分子生物學(xué)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)基因技術(shù)步驟：（1）目的基因的獲??；（2）構(gòu)建重組DNA； （3）重組DNA引入受體細(xì)胞；（4）表達(dá)目的基因受體細(xì)胞的挑選；三、普通生物學(xué)基礎(chǔ)生殖與發(fā)育：有性生殖：是兩個配子融合為一，成為合子或受精卵，再發(fā)育成為新一代個體的生殖方式。第三章植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)小結(jié)：一、植物組織培養(yǎng)（概念、原理、培養(yǎng)條件、常用儀器、步驟

3、、應(yīng)用、人工種子等）概念：是指將植物組織、器官、細(xì)胞、胚胎、原生質(zhì)體等在適當(dāng)培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或長成完整植株的技術(shù)。原理：利用細(xì)胞全能性。培養(yǎng)條件：（1）處于離體狀態(tài)的植物活細(xì)胞； （2）在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件；常用儀器：解剖刀，解剖剪，解剖針，鑷子，高壓滅菌鍋，錐形瓶。步驟：（1）培養(yǎng)材料的采集：理論上全能植物細(xì)胞有3類：A、受精卵B、根尖、莖尖、葉、花、等分生組織細(xì)胞；C、雌雄配子及單倍體細(xì)胞，如花藥、花粉粒等； （2）培養(yǎng)材料的消毒：材料先用自來水沖洗干凈用蒸餾水沖洗（超凈臺）無菌水沖洗無菌濾紙吸干水已消毒解剖刀切成小塊70%酒精浸泡30-60S移入漂白粉飽和液或0

4、.01%升汞消毒10min左右無菌水沖洗無菌濾紙吸干水； （3）制備外植體：用消毒工具將表面消毒的材料做些處理（芽除鱗片，嫩枝除外皮，種子去種皮，去胚乳等。葉片直接切成0.2-0.5cm）； （4）接種和培養(yǎng)：接種封口置培養(yǎng)室培養(yǎng)（25-28，溫度70%-80%，光強(qiáng)3000-4000lx，時長10-16h）繼代培養(yǎng)分化培養(yǎng)（一般在基本培養(yǎng)基中加入一定配比生長素與細(xì)胞分裂素，無菌操作）； （5）誘導(dǎo)生根：將生成不定芽的材料轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根（一般在培養(yǎng)基中加入生長素，無菌操作）； （6）練苗、移栽：幼苗根長到一定長度瓶口打開，自然光照3天移出幼苗自來水沖洗根上培養(yǎng)基移入基質(zhì)（珍珠巖、蛭石

5、）清水噴灑練苗1d移入大田；應(yīng)用：（1）無性系快速繁殖；（2）獲得脫毒苗； （3）選育新品種：a、突變育種；b、原生質(zhì)體融合和細(xì)胞雜交； c、花藥、花粉培養(yǎng)和單倍體植株； （4）有助于遺傳、生理生化、病理研究；（5）保存種質(zhì)資源；（6）產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；人工種子：是指將植物離體培養(yǎng)的胚狀體或芽包裹在含有養(yǎng)分和保護(hù)功能的人工胚乳和人工種皮中的類似種子的顆粒。二、植物細(xì)胞培養(yǎng)（概念、理論基礎(chǔ)、方法分類、培養(yǎng)條件、常用儀器、制備方法、培養(yǎng)方法、保存方法、應(yīng)用、固定化培養(yǎng)及方法等）概念：在離體條件下，將分離的植物細(xì)胞通過繼代培養(yǎng)增殖獲得大量細(xì)胞群體的一種技術(shù)。理論基礎(chǔ)：植物組織培養(yǎng)。方法分類：（1）根據(jù)培養(yǎng)

6、對象分類：單細(xì)胞培養(yǎng)；單倍體培養(yǎng)；原生質(zhì)體培養(yǎng)； （2）按照培養(yǎng)系統(tǒng)分類：懸浮培養(yǎng)；液體培養(yǎng)；固體培養(yǎng)；固定化培養(yǎng)；培養(yǎng)條件：營養(yǎng)鹽、前體和調(diào)節(jié)因子、光照、溫度、攪拌與混合、通氣、PH。常用儀器：機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、鼓泡式生物反應(yīng)器。培養(yǎng)方法：（1）分批培養(yǎng)；（2）流加式培養(yǎng)；（3）半連續(xù)培養(yǎng)；（4）連續(xù)培養(yǎng)；保存方法：（1）繼代培養(yǎng)保存法；（2）低溫保存法；（3）冰凍保存；應(yīng)用：主要用于生產(chǎn)色素、藥物，食品、酶、精細(xì)化工產(chǎn)品等次生代謝物為目的的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。固定化培養(yǎng)：將細(xì)胞固定在載體上，使活細(xì)胞固定在一定的空間范圍進(jìn)行生命活動的技術(shù)。固定化培養(yǎng)方法：（1）吸附法；

7、（2）包埋法；（3）結(jié)合法；（4）交聯(lián)法；三、兩相培養(yǎng)技術(shù)（概念、優(yōu)點(diǎn)、條件）概念：是在培養(yǎng)體系中加入有機(jī)溶劑或者具有吸附作用的多聚化合物。優(yōu)點(diǎn)：不僅減少了產(chǎn)物的反饋抑制作用，從而提高產(chǎn)物含量，而且可以通過有機(jī)相的不斷回收及循環(huán)使用，實現(xiàn)培養(yǎng)的連續(xù)化。條件：（1）添加的有機(jī)物或多聚化合物對植物細(xì)胞無毒，不影響細(xì)胞的生長與產(chǎn)物的合成；（2）產(chǎn)物能較容易地溶解于有機(jī)相中或被多聚化合物吸附；（3）兩相之間分離容易；（4）有機(jī)物或多聚化合物不能吸收培養(yǎng)基中的有效成分；四、植物原生質(zhì)體培養(yǎng)（概念、用途、制備、培養(yǎng)、再生植株等）概念：是去除細(xì)胞壁后裸露的球形細(xì)胞。用途：（1）提供相關(guān)生理生化研究的材料；（

8、2）用作研究基因調(diào)控和表達(dá)、遺傳工程研究的材料；（3）進(jìn)行原生質(zhì)體融合，改變遺傳物質(zhì)，建立雜交品種；（4）用于研究染色體行為、基因定位等；（5）用于細(xì)胞器的分離，或進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞器的遺傳試驗；制備：（1）機(jī)械法：材料放入高滲溶液中，發(fā)生質(zhì)壁分離，最后原生質(zhì)體收縮成球形完全與細(xì)胞壁脫離，此時用剪刀剪碎組織、切碎細(xì)胞壁，使原生質(zhì)體釋放出來。 （2）酶解法：取材消毒酶解制備原生質(zhì)體收集。培養(yǎng)：（1）液體培養(yǎng)法；（2）固體平板法；（3）雙層培養(yǎng)法；再生植株：（1）愈傷組織誘導(dǎo)；（2）誘導(dǎo)胚狀體；思考題：1、什么是植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)？有怎樣的區(qū)別？組織培養(yǎng)：從生物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理條件

9、，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存或生長成組織的技術(shù)。植物組織培養(yǎng)主要是植物無性脫毒快速繁殖技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)：使動植物細(xì)胞在體外條件下存活或生長的技術(shù)，不再形成組織。植物細(xì)胞培養(yǎng)主要是以生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物為目的的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。2、舉例說明植物組織培養(yǎng)的快速繁殖技術(shù)的步驟和方法。1.無菌母株的建立：在無菌條件下，用于試管內(nèi)繼代增殖的植物材料；方法：取嫩枝，沖洗，消毒，切割帶一兩芽的莖段，接種，誘導(dǎo)不定芽形成。2.不定芽（腋芽、愈傷組織、胚狀體）增殖：將獲得的無菌母株，在無菌條件下進(jìn)行再次切割，繼代培養(yǎng)，使在芽眼處形成叢生芽；3.生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)基：提高生長素水平（），降低細(xì)胞分裂素水平(BA0.1

10、-0);改用1/2MS(大量元素減半)或1/4MS (大量元素1/4)4.煉苗：日光鍛煉：通過曬苗，恢復(fù)試管苗葉綠體光合作用功能；2-3天濕度鍛煉：出管前一周打開瓶濕度鍛煉5.移植：將小苗基部培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽于基質(zhì)中。注意保濕，移植10 d 內(nèi)濕度為80-90%.3、植物組織培養(yǎng)的主要意義有哪些？最新進(jìn)展如何？意義：（1）無性系快速繁殖；（2）獲得脫毒苗； （3）選育新品種：a、突變育種；b、原生質(zhì)體融合和細(xì)胞雜交； c、花藥、花粉培養(yǎng)和單倍體植株； （4）有助于遺傳、生理生化、病理研究；（5）保存種質(zhì)資源；（6）產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；進(jìn)展：（1）花卉種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；（2）蔬菜、水果種苗脫毒；（3）

11、瓜果組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；4、植物細(xì)胞培養(yǎng)最主要的用途體現(xiàn)在哪里？舉例說明。主要用途：原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。舉例：經(jīng)濟(jì)海藻江蘺5、植物細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)成分主要包括哪些？（1）無機(jī)鹽：硝酸鹽、銨鹽，鉀、磷、鎂、鈣、硫元素；（2）碳源：蔗糖或葡萄糖，果糖，碳水化合物；（3）植物生長激素：生長素和分裂素，如吲哚乙酸；（4）有機(jī)氮源：蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、谷氨酰胺或氨基酸混合物；（5）有機(jī)酸：丙酮酸或三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物，如檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸。（6）復(fù)合物質(zhì)：生長調(diào)節(jié)劑，包括酵母抽提液、麥芽抽提液、椰子汁和水果汁。6、什么是兩相培養(yǎng)技術(shù)？有什么優(yōu)點(diǎn)？兩相培養(yǎng)技術(shù)：是在培養(yǎng)體系中加入有機(jī)溶劑或者具有吸附作用的多聚

12、化合物。優(yōu)點(diǎn)：不僅減少了產(chǎn)物的反饋抑制作用，從而提高產(chǎn)物含量，而且可以通過有機(jī)相的不斷回收及循環(huán)使用，實現(xiàn)培養(yǎng)的連續(xù)化。7、簡述原生質(zhì)體培養(yǎng)再生完整植株的技術(shù)路線。（1）原生質(zhì)體材料來源：采集江蘺，消毒海水洗刷藻體。取側(cè)生嫩枝切成1-2cm長的切段，放入培養(yǎng)皿中，加MES培養(yǎng)液培養(yǎng)，溫度19-20度，光強(qiáng)2000-2500lx，培養(yǎng)一個月左右，取再生的嫩枝作為分離原生質(zhì)體的材料；（2）原生質(zhì)體分離純化：分離：機(jī)械法或酶解法； 純化：過濾-離心法；漂浮法；沉降法和漂浮法結(jié)合；最終得到原生質(zhì)體懸浮液；（3）再生植株培育：接種原生質(zhì)體于裝有EMS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，同時放置同種江蘺小塊進(jìn)行看護(hù)培養(yǎng)。逐

13、漸增強(qiáng)光照，溫度20度，當(dāng)原生質(zhì)體發(fā)育成的愈傷組織分化出芽后，將其移植進(jìn)大燒杯中用液體EMS培養(yǎng)基通氣培養(yǎng)，光強(qiáng)增至2800-3000lx，培養(yǎng)液每周更換一次。芽球進(jìn)一步發(fā)育生長形成苗，一月左右發(fā)育成完整植株。補(bǔ)充思考題：1、為什么莖尖分生組織培養(yǎng)能夠獲得脫病毒植株？因為莖尖分生組織沒有分化出維管組織，病毒難以感染到這個部位。2、培養(yǎng)基、外植體、玻璃器皿、金屬用具等一般選擇怎樣的滅菌方法？（1）培養(yǎng)基的滅菌：高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌法）（2）外植體的滅菌：酒精、無菌水沖洗；（3）玻璃器皿的滅菌：濕熱滅菌法或干熱滅菌法。 （4）金用具的滅菌：干熱滅菌或火焰滅菌法。 3、目前用作原生質(zhì)體分離的材料有

14、哪些？（1）各種植物的葉片、根尖，也有來自于花粉，尤其是適合制備單倍體的原生質(zhì)體；（2）從組織培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織中獲得；4、哪些類型的外植體適宜用作建立懸浮細(xì)胞系起始培養(yǎng)物？幼胚；胚軸；子葉。5、一個好的植物懸浮細(xì)胞系有哪些特征？（1）懸浮細(xì)胞分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小；（2）細(xì)胞均一性好，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同；（3）細(xì)胞生長迅速，一般2-3天甚至更短時間可增加一倍；6、人工種子利用有何優(yōu)點(diǎn)？（1）便于運(yùn)輸和儲存，快速繁殖；（2）人工胚乳可根據(jù)不同植物的要求配置，通過加入植物激素、有益微生物或抗病、抗蟲成分，使人工種子優(yōu)越于天然種子，更利于種子生長；（3）可以固定雜種優(yōu)

15、勢，可保存珍貴稀有植物品種；（4）利于快速繁殖，生產(chǎn)效率高；（5）可作為植物基因工程和遺傳工程的橋梁；第四章動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)小結(jié)：一、動物細(xì)胞組織培養(yǎng)（概念、原理、培養(yǎng)條件、常用儀器、步驟、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、大規(guī)模培養(yǎng)方法、應(yīng)用、保存方法等）概念：是模擬動物體內(nèi)的生理環(huán)境使細(xì)胞分裂增殖的一種技術(shù)。常用儀器：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔塑料培養(yǎng)板、二氧化碳培養(yǎng)箱、相差顯微鏡；培養(yǎng)條件：溫度、PH、氣體、營養(yǎng)；貼壁培養(yǎng)：（1）將培養(yǎng)物分散成細(xì)胞懸液； （2）過濾、離心、純化、漂洗、接種（玻璃、改性塑料、金屬、微載體）；（3）二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)；二、組織工程（概念、組織培養(yǎng)、應(yīng)用

16、等）組織工程：是利用生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、工程學(xué)原理與技術(shù)，單獨(dú)或組合地利用細(xì)胞、生物材料、細(xì)胞因子實現(xiàn)組織修復(fù)或器官再生的一門技術(shù)。組織培養(yǎng)：（1）上皮組織的體外培養(yǎng)（2）肌肉組織的體外培養(yǎng)（3）神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)三、干細(xì)胞（概念、特性、分類、ES細(xì)胞概念、培養(yǎng)方法及步驟、意義等）概念：是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。特性：干細(xì)胞具有較高的端粒酶活性，因此具有較強(qiáng)的增值能力。（1）緩慢性：干細(xì)胞的增值速度一般比較慢；（2）自穩(wěn)性：干細(xì)胞會自我更新維持自身數(shù)目的恒定。分類：（1）單能干細(xì)胞；（2）多能干細(xì)胞；（3）全能干細(xì)胞；ES細(xì)胞概念：是從著床前胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)分

17、離的一種全能性細(xì)胞。培養(yǎng)方法及步驟：（1）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)獲得：手術(shù)法獲得動物著床前胚胎，用毛細(xì)吸管等工具在顯微鏡下剝離胚胎獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)； （2）原代培養(yǎng)：將胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離后接種在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)； （3）傳代培養(yǎng)：采用胰蛋白酶消化，選擇未分化克隆接種于新的飼養(yǎng)層上或條件培養(yǎng)基中進(jìn)行分化抑制培養(yǎng)； （4）干細(xì)胞鑒定與分化潛能評價：體外分化實驗；體內(nèi)分化實驗；嵌合體形成；核移植；意義：（1）組織或器官修復(fù)；（2）基因治療；思考題：1、什么是動物細(xì)胞、組織培養(yǎng)技術(shù)？動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：是模擬動物體內(nèi)的生理環(huán)境使細(xì)胞分裂增殖的一種技術(shù)。2、與植物細(xì)胞相比，動物細(xì)胞有怎樣的不同？（1）動物細(xì)胞比植物細(xì)胞大，無

18、細(xì)胞壁；（2）動物細(xì)胞倍增時間長，生長緩慢；（3）培養(yǎng)過程需氧量少，對機(jī)械攪拌或剪切力敏感；（4）動物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在；（5）原代細(xì)胞一般繁殖50代左右即退化死亡；（6）動物細(xì)胞對于營養(yǎng)要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、糖外，一般還需血清；（7）對于培養(yǎng)環(huán)境極其敏感，包括PH、溶解氧、溫度、剪切力等；（8）細(xì)菌、真菌、病毒、支原體均可導(dǎo)致動物細(xì)胞培養(yǎng)物的污染；（9）絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞只有貼附在固體或半固體的表面才能生長；3、動物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的關(guān)鍵條件包括哪些？（1）溫度：最適溫度為37度，偏離此溫度，細(xì)胞的正常生長及代謝會受嚴(yán)重影響甚至死亡；（2）PH：細(xì)胞培養(yǎng)的PH最適為7

19、.2-7.4之間，當(dāng)PH低于6或高于7.6時，細(xì)胞的生長會受到影響，甚至導(dǎo)致死亡；（3）氣體：細(xì)胞生長代謝離不開氣體，容器空間中的氧氣和二氧化碳用以保證代謝的進(jìn)行；（4）營養(yǎng)：氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生長因子，血清；4、動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征是怎樣的？（1）貼附型細(xì)胞：細(xì)胞之間相互接觸或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合； a、成纖維細(xì)胞型細(xì)胞；b、上皮型細(xì)胞；c、游走型細(xì)胞；d、多形型細(xì)胞；（2）非貼附型細(xì)胞：此類細(xì)胞體外生長不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，因此也叫懸浮型細(xì)胞，如血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系；5、動物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基有哪幾大類型

20、？各有什么特點(diǎn)？（1）天然培養(yǎng)基：優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好； 缺點(diǎn)：來源有限，成分復(fù)雜；易發(fā)生支原體污染；影響后期分離純化細(xì)胞產(chǎn)物；成本高；（2）合成培養(yǎng)基：優(yōu)點(diǎn)：成分已知，便于對實驗條件控制，能進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；成本低； 缺點(diǎn)：不能完全取代天然培養(yǎng)基，需加血清，有血清干擾；（3）無血清培養(yǎng)基：優(yōu)點(diǎn)：排除了血清的干擾，保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少細(xì)胞污染； 缺點(diǎn)：不同細(xì)胞株添加因子不同，處于研究階段，難于推廣；6、動物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的方法主要有哪些？舉例說明。（1）動物細(xì)胞小規(guī)模培養(yǎng)：懸滴培養(yǎng)；灌注小室培養(yǎng)；培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；培養(yǎng)板培養(yǎng)；轉(zhuǎn)管培養(yǎng)；轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)；（2）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)；微

21、載體培養(yǎng)；多孔載體培養(yǎng)；微囊化培養(yǎng)；中空纖維培養(yǎng)；7、簡述原代培養(yǎng)的基本過程?；具^程：取下組織除雜、剪碎BSS液沖洗、離心取材剪成細(xì)塊BSS液沖洗、自然沉降留少許洗液移入培養(yǎng)瓶中洗盡洗液、加入少許培養(yǎng)液薄層培養(yǎng)24小時左右補(bǔ)充培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長。8、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法有哪些？培養(yǎng)存在什么問題？培養(yǎng)方法：（1）懸浮培養(yǎng)技術(shù)；（2）微載體培養(yǎng)；（3）多孔載體培養(yǎng)； （4）微囊化培養(yǎng)；（5）中空纖維培養(yǎng)；注意問題：（1）細(xì)胞密度低，產(chǎn)物濃度低； （2）細(xì)胞在大規(guī)模、長時間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能力下降； （3）動物細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體成本高； （4）目前對細(xì)胞代謝途徑和生長動

22、力學(xué)的研究比較欠缺； （5）在線監(jiān)測水平技術(shù)不完善；9、簡述微載體培養(yǎng)技術(shù)和微囊化培養(yǎng)技術(shù)的特點(diǎn)。微載體培養(yǎng)：（1）良好的生物相容性、無毒無害；（2）有好的黏附性，一般帶正電荷； （3）大的比表面積，顆粒均勻，孔徑均一；（4）良好的傳質(zhì)性能； （5）強(qiáng)的機(jī)械性能；（6）好的熱穩(wěn)定性；微囊化培養(yǎng)：（1）細(xì)胞包裹在微囊里，在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)； （2）細(xì)胞生長在各自的微小環(huán)境里受到一定的保護(hù)； （3）細(xì)胞總的生長體積有一定增加，且減少了攪拌對細(xì)胞產(chǎn)生的剪切力； （4）細(xì)胞密度增加，細(xì)胞純度提高；10、以動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)為例詳細(xì)說明動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)。關(guān)鍵技術(shù)：（1）理想的細(xì)胞培養(yǎng)基；（2）

23、高效的生物反應(yīng)器； （3）改進(jìn)的細(xì)胞株；（4）簡便有效地產(chǎn)品純化技術(shù)。11、什么是干細(xì)胞？干細(xì)胞培養(yǎng)有什么意義？舉例說明。概念（SC）：是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。意義:（1）組織或器官修復(fù)；（2）基因治療；舉例:造血干細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞與血管；神經(jīng)細(xì)胞；脂肪細(xì)胞；補(bǔ)充思考題：1、動物細(xì)胞體外培養(yǎng)應(yīng)滿足哪些營養(yǎng)成分？氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽、生長因子、激素、輔酶、核酸、嘌呤、嘧啶、血清；2、動物細(xì)胞培養(yǎng)基中為何要添加一定量的血清？血清中含有細(xì)胞生長繁殖和保持細(xì)胞生物學(xué)性狀不可缺少的成分。血清中已知的成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素、金屬離子、促貼附物質(zhì)、生長因子。3、無血清

24、培養(yǎng)在實驗研究中有什么特殊意義？深入研究細(xì)胞生長發(fā)育、分裂繁殖以及衰老分化的生物學(xué)機(jī)制。4、動物細(xì)胞體外培養(yǎng)完全培養(yǎng)基的一般組成是怎樣的？基礎(chǔ)培養(yǎng)基80%-90%；血清5%-20%；碳酸氫鈉2.0g/l；青霉素、鏈霉素各100單位/l；5、動物細(xì)胞培養(yǎng)液中酚紅的主要作用是什么？監(jiān)檢培養(yǎng)液中的PH變化。6、動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的原則應(yīng)考慮哪些方面？（1）安全性；（2）連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系；（3）對固體基質(zhì)的要求（微珠載體）；（4）理化性質(zhì)（溫度、PH、緩沖液）；（5）對設(shè)備的要求（超凈臺或安全操作間）；（6）對培養(yǎng)基的要求（無機(jī)離子、碳源、有機(jī)養(yǎng)料、抗生素、蛋白質(zhì)、多肽、微量元素）；7、使用液氮罐進(jìn)行細(xì)胞

25、冷凍保存時應(yīng)注意哪些問題？（1）減少細(xì)胞內(nèi)冰晶對細(xì)胞造成的損傷；（2）防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶；（3）采用DMSO對二倍體細(xì)胞毒性小，保護(hù)作用好于甘油；（4）最好保存在氣態(tài)層；8、動物細(xì)胞冷凍保存技術(shù)中凍存和復(fù)蘇的原則是什么？冷凍保存動物細(xì)胞的基本操作步驟是怎樣的？復(fù)蘇的方法步驟又是怎樣的？原則：慢凍快融；冷凍：（1）細(xì)胞經(jīng)消化分散后，用冷凍保護(hù)液冷卻，同時將細(xì)胞懸液稀釋； （2）按1ml/安瓶的量分裝細(xì)胞懸液，在火焰下將安瓶封口； （3）將封口的安瓶放入慢凍機(jī)內(nèi)，按每min下降一度的速度緩慢冷卻； （4）凍結(jié)好的安瓶放入二氧化碳低溫冰柜或液氮罐中；復(fù)蘇：（1）將冰凍的安瓶取出后放

26、入37度水浴中1min左右，使其快速融化； （2）5min內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10min；（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞（除去防凍劑）；9、如何鑒定ES細(xì)胞？（1）堿性磷酸酶（AKP）活性：未分化的ES細(xì)胞中含有豐富的堿基磷酸酶，活性很高；而已經(jīng)分化的ES細(xì)胞中堿性磷酸酶呈現(xiàn)弱陽性或陰性，因此，可鑒定ES細(xì)胞是否分化；（2）ES細(xì)胞表面可以檢測到特異性表面抗原（SSEA-1），因此，SSEA-1也作為ES細(xì)胞鑒定的一個標(biāo)志；10、簡述ES細(xì)胞建系的主要操作步驟？(1) ES細(xì)胞的分離獲得；（2）ES細(xì)胞的分化抑制培養(yǎng)；（3）ES細(xì)胞系的建立及保存：ES

27、細(xì)胞的分離；ES細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)與細(xì)胞系的建立；ES細(xì)胞的冷藏；11、追蹤了解ES細(xì)胞的研究進(jìn)展，分析討論其應(yīng)用前景及其面臨的問題。應(yīng)用前景：（1）組織或器官修復(fù)；（2）基因治療；面臨問題：（1）來源限制：由于需要胚胎作為胚胎干細(xì)胞分離的材料，因此人類胚胎干細(xì)胞研究存在細(xì)胞來源限制問題； （2）體外培養(yǎng)困難:由于胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)會自發(fā)分化，而且機(jī)制還不清楚，控制胚胎干細(xì)胞分化的抑制的技術(shù)有待完善； （3）安全性：胚胎干細(xì)胞和多能成體干細(xì)胞的自發(fā)分化方向是多向的，干細(xì)胞移植后的成瘤性風(fēng)險比較大； （4）倫理道德問題：獲取人的胚胎干細(xì)胞、體外培養(yǎng)的胚囊是否具有生命使人類胚胎干細(xì)胞研究面臨倫理道德

28、問題；第五章細(xì)胞融合小結(jié)：一、細(xì)胞融合的概念、意義、基本原理、技術(shù)方法、影響因素概念：又稱體細(xì)胞雜交，是指使用人工方法使兩個或兩個以上的細(xì)胞通過細(xì)胞膜融合合并形成一個細(xì)胞的技術(shù)。意義：（1）應(yīng)用于生物遺傳性狀改良，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙；（2）培育新品種，新菌株；（3）創(chuàng)造細(xì)胞質(zhì)雜種；（4）生產(chǎn)單克隆抗體；（5）疾病診斷，基因治療；（6）基因定位和繪制人類基因圖譜；基本原理：細(xì)胞膜的流動性。技術(shù)方法：（1）兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近；（2）質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋； （3）胞質(zhì)滲透；（4）細(xì)胞核融合；影響因素：（1）PEG的分子量與濃度；（2）PEG的PH值，8.0-8.2融合效果最好； （3）PEG

29、的處理時間；（4）融合時的溫度；二、細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用動物細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體（制備方法、一般過程）單抗技術(shù)的要點(diǎn)是從經(jīng)某種抗原（如：甲抗原）免疫過的小鼠脾臟分離得到脾細(xì)胞（大部份為 B-淋巴細(xì)胞），用以和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合雜交。所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞再經(jīng)單細(xì)胞培養(yǎng)挑選，即可獲得能產(chǎn)生專門針對甲抗原，甚至僅僅針對甲抗原大分子中某個抗原決定簇的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。思考題：1、什么是細(xì)胞融合？有怎樣的意義？（同上一）2、怎樣制備植物或微生物細(xì)胞的原生質(zhì)體和動物細(xì)胞的單個細(xì)胞？把一個完整的植物細(xì)胞放入纖維素果膠酶中水解去外層細(xì)胞膜可得植物細(xì)胞的原生質(zhì)體 動物細(xì)胞的單核細(xì)胞：用胰蛋白酶處理一塊

30、組織，讓其分解成為單個細(xì)胞3、細(xì)胞融合的主要方法有哪些？特點(diǎn)分別是怎樣的？（1）生物法：優(yōu)點(diǎn)：融合率較高，對各種動物細(xì)胞都適宜，且仙臺病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)； 缺點(diǎn)：仙臺病毒不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性或降低，并且制備過程比較繁瑣，此外，病毒引進(jìn)細(xì)胞后，可能對細(xì)胞的生命活動產(chǎn)生干擾；（2）化學(xué)法：優(yōu)點(diǎn)：融合成本低，不需特殊設(shè)備；融合過程不受物種限制；融合效果穩(wěn)定；融合率較高； 缺點(diǎn)：融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害；（3）物理法：優(yōu)點(diǎn)：融合率高，重復(fù)性與可控性強(qiáng)；裝置精巧、方便簡單；不需加PEG等外源因子，毒性小； 缺點(diǎn)：可能會造成不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷；融合大小不同、膜成分不同的細(xì)

31、胞時存在困難；電場強(qiáng)度等參數(shù)難把握；4、怎樣選擇融合后獲得的雜合細(xì)胞？（融合的雜種細(xì)胞如何選擇？）（1）抗藥性篩選法；（2）營養(yǎng)互補(bǔ)篩選法；（3）物理特性篩選法；（4）熒光標(biāo)記法；5、簡述利用雜交瘤技術(shù)進(jìn)行單克隆抗體大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)步驟與要點(diǎn)？淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟包括：動物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等。6、怎樣利用原生質(zhì)體融合與培養(yǎng)技術(shù)制造新物種？舉例說明。1砧木改良2栽培（接穗）品種改良（1）引進(jìn)果樹野生或近緣種類的有益性狀。（2）克服有性雜交障礙，實現(xiàn)品種類型間優(yōu)良性狀的組合（3）培育無子（核）果樹品種。（4）創(chuàng)造果樹新種質(zhì)。（

32、5）有助于果樹育種基礎(chǔ)研究。補(bǔ)充思考題：1、PEG融合與電融合的原理及影響因素。PEG融合原理：（1）PEG分子具有弱負(fù)極性，可能與具有正極性基團(tuán)的水分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸； （2）PEG可以改變細(xì)胞膜的物理和化學(xué)性質(zhì)，增加類脂膜的流動性，使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合，從而促進(jìn)細(xì)胞融合；影響因素：（1）PEG的分子量與濃度；（2）PEG的PH值，8.0-8.2融合效果最好； （3）PEG的處理時間；（4）融合時的溫度；電融合的原理：在直流電脈沖的刺激下，細(xì)胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞或原生質(zhì)體黏合

33、并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而連接，直到閉合成完整的膜形成融合體。影響因素：（1）交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電場的處理時間； （2）直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)；2、單克隆抗體生產(chǎn)中HAT的篩選原理是什么？HAT選擇培養(yǎng)基中三中關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）細(xì)胞融合前必須做骨髓瘤細(xì)胞對HAT選擇培養(yǎng)基敏感性試驗，不敏感的不能用于細(xì)胞融合。第六章染色體工程小結(jié)：一、染色體工程的概念、意義概念：是按照一定的設(shè)計，有計劃地消減、添加或替換同種或異種染色體從而達(dá)到定向改變遺傳性狀和選育新品種的一種技術(shù)。意義：染色體工程不僅在培育新品種上有重要意義，而且也是基因定位和

34、染色體轉(zhuǎn)移等基礎(chǔ)研究的有效手段。二、多倍體育種的意義、誘導(dǎo)方法、鑒定方法等意義：（1）創(chuàng)造新物種、新作物成新品種；（2）通過染色體，克服遠(yuǎn)緣雜交的困難；誘導(dǎo)方法：（1）生物法（不成熟）：胚乳培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交等； （2）物理法（主要用于育種初期）：溫度激變（溫度休克法）、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射、離心、水靜壓法、高鹽高堿法； （3）化學(xué)法（最普遍）：秋水仙素、細(xì)胞松弛素B等；鑒定方法：1、間接法：（1）核體積測量法；（2）形態(tài)學(xué)檢查法；（3）蛋白質(zhì)電泳法；（4）生化分析； 2、直接法：（1）染色體計數(shù)法；（2）DNA含量測定法；三、單倍體育種的意義、獲得途徑、花藥培養(yǎng)的一般程序等意義：單倍體是進(jìn)行染色

35、體遺傳分析的理想材料。通過人工方法是單倍體的染色體加倍就可以獲得純合二倍體，具有可育性。這種方法可縮短育種年限，大大提高了選育效率，在育種上具有極高的利用價值。獲得途徑：1、利用單性生殖獲得單倍體：(1)從雙生苗中選擇；（2）利用半配合； （3）利用遠(yuǎn)緣花粉授粉；（4）利用延遲授粉； （5）利用誘發(fā)單倍體基因及核質(zhì)互作；（6）利用理化因素誘變； 2、利用合子發(fā)育過程中體細(xì)胞染色體有選擇性的消失； 3、組織和細(xì)胞的離體培養(yǎng)：（1）花藥粉培養(yǎng)；（2）未授粉的子房、胚珠培養(yǎng)；一般程序：（1）選擇誘導(dǎo)單倍體的材料；（2）雄花的獲得，花藥的制備與培養(yǎng)； (3)愈傷組織培養(yǎng)；（4）移植；（5）染色體加倍獲

36、得二倍體； （6）花粉植株后代的選育；思考題：染色體變異包括哪些？什么是染色體工程？染色體變異：（1）染色體結(jié)構(gòu)變異（染色體易位、缺失、倒位、重復(fù)）； （2）染色體數(shù)目變異；染色體工程：是按照一定的設(shè)計，有計劃地消減、添加或替換同種或異種染色體從而達(dá)到定向改變遺傳性狀和選育新品種的一種技術(shù)。2、多倍體和單倍體是怎樣形成的？動植物有什么不同？多倍體：（1）原種或雜種所形成的未減數(shù)配子；（2）原種或雜種的合子的染色體加倍；單倍體：獲得途徑（同上三）不同：奇數(shù)多倍體是不能通過有性生殖產(chǎn)生后代的，這一點(diǎn)動植物都一樣。因為在減數(shù)分裂的四分體時期，會聯(lián)會紊亂，導(dǎo)致無法產(chǎn)生配子（或正常配子），也就不能產(chǎn)生后

37、代，所以是不可育。但無論是怎樣的多倍體植物都可以通過植物組織培養(yǎng)的方法產(chǎn)生新個體。3、經(jīng)常采用的人工誘導(dǎo)多倍體形成手段有哪些？舉例說明多倍體育種的意義？手段：（1）生物法（不成熟）：胚乳培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交等； （2）物理法（主要用于育種初期）：溫度激變（溫度休克法）、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射、離心、水靜壓法、高鹽高堿法； （3）化學(xué)法（最普遍）：秋水仙素、細(xì)胞松弛素B等；意義：（1）無性繁殖能固定多倍體的優(yōu)良性狀；（2）可利用基倍數(shù)的多倍體，產(chǎn)生無籽或少籽的果實；（3）利用多倍體改善育性；（4）可利用高倍性的多倍體；補(bǔ)充思考題：1、常用的獲得單倍體的途徑有哪些？舉例說明單倍體育種的意義如何？途徑：1、

38、利用單性生殖獲得單倍體：(1)從雙生苗中選擇；（2）利用半配合； （3）利用遠(yuǎn)緣花粉授粉；（4）利用延遲授粉； （5）利用誘發(fā)單倍體基因及核質(zhì)互作；（6）利用理化因素誘變； 2、利用合子發(fā)育過程中體細(xì)胞染色體有選擇性的消失； 3、組織和細(xì)胞的離體培養(yǎng)：（1）花藥粉培養(yǎng)；（2）未授粉的子房、胚珠培養(yǎng)；意義：單倍體是進(jìn)行染色體遺傳分析的理想材料。通過人工方法是單倍體的染色體加倍就可以獲得純合二倍體，具有可育性。這種方法可縮短育種年限，大大提高了選育效率，在育種上具有極高的利用價值。2、利用花藥培養(yǎng)獲得單倍體染色體加倍植株的一般程序是怎樣的？（1）選擇誘導(dǎo)單倍體的材料；（2）雄花的獲得，花藥的制備與

39、培養(yǎng)；(3)愈傷組織培養(yǎng)；（4）移植；（5）染色體加倍獲得二倍體；（6）花粉植株后代的選育；3、簡述多倍體的主要鑒定方法。1、間接法：（1）核體積測量法；（2）形態(tài)學(xué)檢查法；（3）蛋白質(zhì)電泳法；（4）生化分析； 2、直接法：（1）染色體計數(shù)法；（2）DNA含量測定法；第七章胚胎工程小結(jié)：一、胚胎工程的概念、意義、技術(shù)方法等概念：是指對動物早期胚胎或配子進(jìn)行工程技術(shù)操作，獲得所需要的成體動物的技術(shù)。意義：（1）提高優(yōu)良動物的繁殖能力；（2）促進(jìn)動物改良的速度；（3）作為胚胎操作的基礎(chǔ)；技術(shù)方法：體外受精；胚胎移植；胚胎分割與融合；胚胎與精子、卵子冷凍、保存；胚胎性別控制；胚胎細(xì)胞核移植；基因?qū)?/p>

40、。二、人工受精的概念、主要技術(shù)環(huán)節(jié)概念：是指用特定的器械，采集公畜的精液，通過檢查、稀釋、保存等適當(dāng)處理后，再用器械把精液輸送到發(fā)情母畜的生殖道，以代替公母畜自然交配而繁殖后代的一種繁殖技術(shù)。技術(shù)環(huán)節(jié)：采精精液品質(zhì)檢查精液的稀釋精液的分裝精液的保存（液態(tài)保存；冷凍保存）精液的運(yùn)輸冷凍精液的解凍與檢查輸精；三、胚胎移植的概念、主要技術(shù)環(huán)節(jié)、超數(shù)排卵的概念概念：是指將發(fā)育到一定階段的胚胎移植到與供體同時發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的“受體”母畜輸卵管或子宮的技術(shù)。技術(shù)環(huán)節(jié)：（1）供受體的同期發(fā)情：供體的超數(shù)排卵；供體的發(fā)情鑒定與配種。 （2）胚胎的采集：胚胎的檢查與鑒定；胚胎的移植。超數(shù)排卵：是指在母畜發(fā)

41、情周期的適當(dāng)時間用人工的方法促使其有更多的卵泡發(fā)育、成熟、排卵的一項技術(shù)。四、胚胎融合的實例（1）將同一種類的黑鼠和白鼠胚胎融合，可以獲得多個黑白相間的花鼠；（2）將不同種的綿羊和山羊的胚胎融合，可得到擁有綿羊和山羊雙重特性的新品種-綿山羊；五、胚胎冷凍保存技術(shù)常用方法 （1）儀器程序逐步降溫冷凍；（2）徒手操作的快速玻璃化冷凍； （3）一步冷凍法；（4）快速降溫法；六、試管動物的概念、培育的一般流程概念：是指將供體的精子和卵子在體外受精，體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育到一定階段通過胚胎移植移入受體完成發(fā)育出生的動物。一般流程：雌性供體的超排卵處理；良種雄性供體人工受精人工受精采集受精卵分類、體外培養(yǎng)或胚胎

42、冷凍保存雌性受體的選擇與胚胎移植體內(nèi)發(fā)育與后代降生。思考題：1、什么是胚胎工程？其基本技術(shù)有哪些？胚胎工程：是指對動物早期胚胎或配子進(jìn)行工程技術(shù)操作，獲得所需要的成體動物的技術(shù)?；炯夹g(shù)：體外受精；胚胎移植；胚胎分割與融合；胚胎與精子、卵子冷凍、保存；胚胎性別控制；胚胎細(xì)胞核移植；基因?qū)搿?、簡述胚胎移植的原理與一些關(guān)鍵技術(shù)的特點(diǎn)。原理：胚胎移植又稱受精卵移植，俗稱人工授胎或借腹懷胎，是指將雌性動物的早期胚胎，或者通過體外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同種的、生理狀態(tài)相同的其他雌性動物體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育為新個體的技術(shù)。特點(diǎn)：手術(shù)法移植：手術(shù)法是將動物固定、全身麻醉或局部麻醉后，清理手術(shù)部

43、位。在背部或腹中線開口，進(jìn)行輸卵管移植時，把吸好胚胎的移植管由輸卵管傘口插入管內(nèi)，盡量插的深一些。然后把胚胎吹入輸卵管內(nèi)。復(fù)位、縫合。非手術(shù)移植：用人工受精管，通過子宮頸進(jìn)入子宮體，然后注入胚胎，但只適用于晚期胚胎。3、什么是試管動物？是怎樣培育的？試管動物：是指將供體的精子和卵子在體外受精，體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育到一定階段通過胚胎移植移入受體完成發(fā)育出生的動物。培育過程：（1）精子采集與體外獲能、卵子采集與成熟培養(yǎng)；（2）體外受精；（3）重組胚激活與體外培養(yǎng)；（4）胚胎移植；（5）體外發(fā)育、出生；4、以試管嬰兒為例，分析試管動物的技術(shù)方法，以及對人類的意義。意義：（1）可以研究受精機(jī)理，治療人類男

44、性和動物的生殖不育； （2）可以利用體外受精卵的發(fā)育狀況或染色體核型檢測形態(tài)不正常精子其染色體是否正常；（3）可以產(chǎn)生大量的動物個體； （4）可以簡化繁雜的凍精技術(shù)，或許只保存核物質(zhì)即可達(dá)到受精目的。補(bǔ)充思考題：1、簡述超數(shù)排卵的基本方法及其意義?；痉椒ǎ菏窃趧游锇l(fā)情周期的適當(dāng)時期，利用外源性促性腺激素對雌性動物卵巢進(jìn)行處理，誘發(fā)其卵巢上大量卵泡同時發(fā)育并排卵。意義：人工使用藥物誘發(fā)超排卵，能掌握并隨意控制排卵時間。2、簡述胚胎移植的主要操作過程，分析影響胚胎移植成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。操作過程：（1）同期發(fā)情；（2）胚胎移植；（3）妊娠診斷影響環(huán)節(jié)：（1）胚胎質(zhì)量：（2）操作技術(shù)；（3）受體；3、

45、比較幾種胚胎冷凍保存技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。（1）常規(guī)冷凍法：慢速冷凍法、逐步降溫。（2）一步冷凍法：是由慢速冷凍法改進(jìn)而來，細(xì)管內(nèi)的冷凍液和蔗糖液是分開的，因此，在細(xì)管內(nèi)用蔗糖液可一步脫除甘油抗凍劑，從而利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。（3）程序冷凍法：采用較低濃度的冷凍保護(hù)劑，對胚胎毒性損害小，解凍后存活率較高。操作繁瑣，降溫速度慢，致使所需時間長，需要特殊的降溫裝置。（4）玻璃化冷凍法：簡化冷凍過程，是一種簡便、快速、有效的冷凍方法，不需冷凍儀器。第八章細(xì)胞重組與克隆技術(shù)小結(jié)：一、細(xì)胞重組的概念、主要方式、主要操作技術(shù)等概念：是指從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組分然后在體外一定條件下將不同細(xì)胞來源的細(xì)胞器及其組

46、分進(jìn)行重組，使其重新裝配成為具有生物活性的細(xì)胞或細(xì)胞器的一種實驗技術(shù)。主要方式：（1）胞質(zhì)體與完整細(xì)胞重組形成胞質(zhì)雜種； （2）微細(xì)胞與完整細(xì)胞重組形成微細(xì)胞異核體； （3）胞質(zhì)體與核體重新組合形成重組細(xì)胞；主要操作技術(shù)：（1）供體和受體制備（供體：囊胚細(xì)胞或成體細(xì)胞；受體：成熟的卵細(xì)胞）； （2）去卵膜和卵核；（3）供體細(xì)胞制備； （4）移核（30-40min，16-18）激活，重組胚體內(nèi)或體外培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎體內(nèi)發(fā)育至產(chǎn)出等程序。二、胞質(zhì)體、微細(xì)胞、核體的概念及其制備方法胞質(zhì)體：用細(xì)胞松弛素B處理體外培養(yǎng)細(xì)胞能誘發(fā)其排核，結(jié)合高速離心，得到了胞質(zhì)體。微細(xì)胞：秋水仙素及其衍生物和長春新堿

47、等有絲分裂阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，而使染色體停滯在有絲分裂中期。經(jīng)體外培養(yǎng)，在單個染色體或染色體周邊就會重現(xiàn)核膜而形成含有一個微核、一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個完整質(zhì)膜的微細(xì)胞。核體：與胞質(zhì)分離得到的細(xì)胞核，帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜，稱為“核體”。 去核前作預(yù)離心，可去除貼壁不牢的完整細(xì)胞，去核處理后，從離心管底部收集樣品；三、克隆的概念、應(yīng)用意義及存在問題概念：是將動物體細(xì)胞經(jīng)過抑制培養(yǎng)使其處于休眠狀態(tài)應(yīng)用意義：（1）檢驗動物細(xì)胞全能性；（2）加速動物繁殖、優(yōu)良品種、保護(hù)珍稀動物； （3）醫(yī)療領(lǐng)域；存在問題：（1）技術(shù)尚不成熟；（2）克隆動物的體細(xì)胞突變、壽命及其他遺傳問題； （3）是否是完全的“

48、復(fù)制”；（4）來自克隆動物的可應(yīng)用性的思考； （5）社會學(xué)和倫理學(xué)問題；四、細(xì)胞核移植的概念及其技術(shù)要點(diǎn)、以細(xì)胞核移植為核心技術(shù)的克隆動物的基本方法、利用細(xì)胞核移植技術(shù)制備克隆動物的一般程序概念：是利用顯微鏡操作技術(shù)將一種動物的細(xì)胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)。 技術(shù)要點(diǎn)：（1）供體和受體制備（供體：囊胚細(xì)胞或成體細(xì)胞；受體：成熟的卵細(xì)胞）； （2）去卵膜和卵核；（3）供體細(xì)胞制備； （4）移核（30-40min，16-18）激活，重組胚體內(nèi)或體外培養(yǎng)、胚胎移植、胚胎體內(nèi)發(fā)育至產(chǎn)出等程序。一般程序：核供體細(xì)胞的獲得與取核受體細(xì)胞去核（盲吸去核法；功能性去核法；化學(xué)誘導(dǎo)去核）細(xì)胞

49、核移植（直接注射法；透明帶下注射法）重組胚的激活（電激活；化學(xué)激活）重組胚培養(yǎng)和移植（體外培養(yǎng)；體內(nèi)培養(yǎng)）核移植動物鑒定；五、“多莉”羊克隆的實例思考題：1、什么是細(xì)胞重組？細(xì)胞重組的技術(shù)方法有哪些？（同上一）2、克隆定義的來源和發(fā)展是怎樣的？來源：“克隆”一詞來源于希臘語，原意是用于扦插的枝條，也就是指無性繁殖。本意是指遺傳上完全相同的分子、細(xì)胞或來自同一祖先的生物個體的無性繁殖群體。發(fā)展：1在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)；2在細(xì)胞水平，克隆實質(zhì)由一個單一的共同祖先細(xì)胞分裂所形成的一個細(xì)胞群體；3在個體水平，克隆是指基因型完全相同的兩個或更多的個體組成的一個群體。3、克隆的

50、基本方法有哪些？什么是細(xì)胞核移植技術(shù)？基本方法：（1）胚胎分割；（2）胚胎細(xì)胞核移植；（3）胚胎干細(xì)胞核移植；（4）胚胎嵌合；（5）體細(xì)胞核移植；細(xì)胞核移植技術(shù)：是一種利用顯微操作技術(shù)將一種動物的細(xì)胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵內(nèi)的精細(xì)技術(shù)。4、多莉羊是怎樣培育出的？它與早期的其他克隆動物有什么不同？為什么說它是克隆技術(shù)的里程碑？操作流程：（1）核供體細(xì)胞：取白色芬蘭多特西母羊的乳腺組織，酶消化分解成單個細(xì)胞； （2）受體卵細(xì)胞：來自蘇格蘭黑面母綿羊，注射促性腺釋放素后，收集卵細(xì)胞； （3）重組胚構(gòu)建與激發(fā)：乳腺細(xì)胞核與無核卵放入同一培養(yǎng)基中，將乳腺細(xì)胞核融入卵細(xì)胞中形成一個含有新遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞； （4）胚胎移植：將重組胚種植在綿羊結(jié)扎的輸卵管中培養(yǎng)，大約培養(yǎng)6d； （5）妊娠發(fā)育出生：60d時用超聲波診斷妊娠，產(chǎn)下多莉；里程碑： “多莉”的誕生，意味著人類可以利用動物的一個組織細(xì)胞，大量生產(chǎn)出相同的生命體，這無疑是基因工程研究領(lǐng)域的一大突破。5、怎樣正確看待克隆技術(shù)？其現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢是怎樣的？看待：（1）不能因噎廢食，要繼續(xù)進(jìn)行我國克隆技術(shù)的研究；（2）堅持正確的宣傳引導(dǎo)；(3)提高科