液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

1、 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀摘要：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)的現(xiàn)代分析手段。本文介紹了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的分析特點(diǎn)及關(guān)鍵技術(shù)，并詳細(xì)介紹了該技術(shù)應(yīng)用情況，以“應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定化妝品中12種磺胺類藥物”為例詳細(xì)說(shuō)明了該技術(shù)的應(yīng)用方法及優(yōu)化條件。最后展望了該技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。關(guān)鍵詞：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、分析條件、優(yōu)化條件Abstract:LC-MSisamodernanalyticaltoolswithliquidchromatographyasaseparationsystemandmassspectrometryasadetection

2、system.Thispaperintroducesboththecharacteristicsoftheliquidchromatography-massspectrometrytechnologyanditskeytechniques,andshowstheapplicationofthistechnology,andtakesDeterminationof12kindsofsulfonamideresiduesincosmeticsbyLC-MS-MSmethodasanexampletoexplainitsapplicationandoptimalconditionsindetail.

3、Finally，thefuturedevelopmentandofthetechnologyisprospected.Keywords:liquidchromatography-massspectrometry,analyticalconditions,theoptimumconditions1前言液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng),質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開(kāi)，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相

4、對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。LC-MS除了可以分析氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）所不能分析的強(qiáng)極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定性的化合物之外，還具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：分析范圍廣、分離能力強(qiáng)、定性分析結(jié)果可靠、檢測(cè)限低、分析時(shí)間快、自動(dòng)化程度高2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀主要由高效液相色譜、接口裝置（同時(shí)也是離子源）、質(zhì)譜儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)構(gòu)成。高效液相色譜儀和一般的液相色譜儀基本相同，其作用是將混合物試樣分離后進(jìn)入質(zhì)譜儀。該儀器生物關(guān)鍵部分是LC和MS之間的接口裝置，其主要作用是出溶劑并使試樣離子化。由于接口裝置同時(shí)就是離子源，

5、因此質(zhì)譜儀部分只包括質(zhì)量分析器，對(duì)進(jìn)入的離子進(jìn)行質(zhì)量分離，分離后的離子按質(zhì)量的大小先后由收集器收集，并記錄質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用儀器3關(guān)鍵技術(shù)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的關(guān)鍵在于：如何將液相色譜過(guò)程使用的流動(dòng)相與樣品分開(kāi)，如何使極性大、難揮發(fā)、相對(duì)分子質(zhì)量大的樣品完全離子化并引入質(zhì)譜分析器。3.1接口技術(shù)LC/MS最重要的位置是接口裝置。樣品經(jīng)液相色譜分離，進(jìn)入質(zhì)譜，要除去溶劑并使其電離，同時(shí)要求液相色譜的高流速與質(zhì)譜的氣相和高真空度條件相匹配。接口的作用就是將被分析的樣品分子電離成帶電離子，并使這些離子在離子光學(xué)系統(tǒng)的作用下匯聚成一定幾何形狀和一定能量的離子束，然后進(jìn)入質(zhì)量分析器被分離。這是當(dāng)時(shí)解決聯(lián)用技術(shù)的最

6、大難題。自20世紀(jì)70年代初，人們開(kāi)始致力于液-質(zhì)聯(lián)用接口技術(shù)的研究。在開(kāi)始的20年中處于緩慢的發(fā)展階段，研制出了許多種聯(lián)用接口，但均沒(méi)有應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。直到大氣壓離子化(atmospheric-pressureionization,API)接口技術(shù)的問(wèn)世,液-質(zhì)聯(lián)用才得到迅猛發(fā)展，廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析和應(yīng)用領(lǐng)域。主要有大氣壓電離接口、熱噴霧電離接口、離子束電離接口等，大氣壓電離接口是現(xiàn)有商品化儀器中最為普遍的電離接口。3.2、基質(zhì)效應(yīng)321基質(zhì)效應(yīng)的來(lái)源LC-MS中的基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象最初在1993年被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)改變樣品基質(zhì)的種類和濃度時(shí)，待測(cè)物電噴霧化質(zhì)譜的響應(yīng)值降低了。美國(guó)FDA2001年出

7、版的生物分析方法驗(yàn)證準(zhǔn)則明確提出：在LC-MS分析方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證過(guò)程中需要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)?；|(zhì)效應(yīng)是指樣品中除了待測(cè)物以外的其他基質(zhì)成分對(duì)待測(cè)物測(cè)定值的影響，它源自色譜分離過(guò)程中與被測(cè)物共流出的物質(zhì)對(duì)被測(cè)物離子化過(guò)程的影響，共流出干擾物可分為內(nèi)源性雜質(zhì)和外源性雜質(zhì)。內(nèi)源性雜質(zhì)是指樣品提取過(guò)程中同時(shí)被提取出來(lái)的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子，當(dāng)這些物質(zhì)在共提取液中濃度較高，并與目標(biāo)化合物共流出色譜柱進(jìn)入離子源時(shí)，將嚴(yán)重影響目標(biāo)化合物的離子化過(guò)程。外源性雜質(zhì)通常易被人們忽視，但也會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)。這些干擾物由樣品前處理各步驟引入,文獻(xiàn)報(bào)道的主要包括的聚合物殘留、酞酸鹽、去污劑降解產(chǎn)物、離子對(duì)試劑、有機(jī)酸等

8、離子交換促進(jìn)劑、緩沖鹽或SPE小柱材料及色譜柱固定相釋放的物質(zhì)等。3.22基質(zhì)效應(yīng)的確認(rèn)方法目前報(bào)道的缺人基質(zhì)效應(yīng)的方法有兩種，一種是標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定法，另一種方法是利用柱后灌注技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。3.23基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的存在會(huì)嚴(yán)重影響對(duì)待測(cè)物的定量準(zhǔn)確度和精密度，且影響因素多變,很難被完全消除。近兒年來(lái)，致力于消除和補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的研究逐漸增多，主要包括優(yōu)化質(zhì)譜條件，優(yōu)化色譜分離體系，多步凈化措施，使用內(nèi)標(biāo)物定量，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，回聲峰技術(shù)等。4、應(yīng)用隨著聯(lián)用技術(shù)的日趨完善，HPLC-MS逐漸成為最熱門的分析手段之一。特別是在分子水平上可以進(jìn)行蛋白質(zhì)、多肽、核酸的分子量確認(rèn)，氨基酸和堿

9、基對(duì)的序列測(cè)定及翻譯后的修飾工作等，這在HPLC-MS聯(lián)用之前都是難以實(shí)現(xiàn)的。HPLC-MS作為已經(jīng)比較成熟的技術(shù)，目前己在生化分析、天然產(chǎn)物分析、藥物和保健食品分析以及環(huán)境污染物分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。4.1應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定化妝品中12種磺胺類藥物4.11分析條件4.111色譜條件8色譜柱，5Lm,211mm150mm;流速:0125mL/min;柱溫:30e;進(jìn)樣量:25LL;流動(dòng)相:流動(dòng)相A為U=011%的甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇；洗脫梯度程序見(jiàn)表1。表1分離12種磺胺類藥物的洗脫梯度TablElutionconditionfordeterminationof12k

10、indsofsulfonamidet/mill0（0-1%的甲酸水溶液）/%*（甲醇）/%096439641070302065353010904.112質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：正離子掃描;檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)；干燥氣:N2;霧化氣壓力：27518kPa;干燥氣溫度:340e;干燥氣流速:8L/min。12種磺胺類藥物質(zhì)譜分析的條件參數(shù)如表2所示。表212種磺胺類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Tab212ParameterofMassspectraof12kindsofsulfonamide祓測(cè)物質(zhì)名稱定量離子定性離子碎裂電壓V匹撞能量V磺胺瞇215-1/156215-1/108;21

11、5.1-1564025/10磺胺醋酰214-9/156214.9.-156;214.9.-108405/15磺肢腳辰25L1/156251.1/156;251.1/1084010/20磺胺噱魁256.1/156236.1/156;256.1.1084010/25磺胺毗囁250.1/156250-.1/156;250-1.183.810015/15磺胺甲基喘唳265.1/156265.1/156;265.1/171.84015/15磺胺對(duì)甲氧咗噬281.1/156281.1/156;281.1/1084015/20磺胺二甲基咗嚨279.1/156279-1.-156;279.1185.64010

12、/10磺腔甲氧噠嗪281.1/156281.1/156;281.1/187.810015/15285-0/156285-0/156;285.0/1084015/15磺肢甲基異左呼254.1/108254.1/156;254.1108&015/30磺胺間二甲氧噸唏31L1/15631b1.156;31L1-1084020/304.12樣品處理稱取化妝品110g（精確到01001g）于50mL容量瓶中，用乙睛定容至刻度，充分搖勻后超聲提取20min,上層提取液經(jīng)濾紙過(guò)濾，將25mL濾液吸取至100mL蒸發(fā)瓶?jī)?nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)器上，于40e水浴中減壓蒸餾至干，用5mL水溶解，加入5mL正己烷渦旋30

13、s,靜置分層，棄掉上層正己烷，再加5mL正己烷渦旋30s,靜置分層，棄去正己烷層，移取3mL水相于5mL聚丙烯離心管中，以10000r/min離心10min,過(guò)0120Lm濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。4.13結(jié)果與討論4.131樣品提取磺胺類藥物易溶于乙腈，而且乙腈又有較強(qiáng)的清除蛋白能力，因此利用乙腈作為提取溶劑。超聲波提取20min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)富集提取液，用水溶解,正己烷脫脂，再經(jīng)C18色譜柱將樣品測(cè)定液中磺胺類藥物進(jìn)行有效分離，利用串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，該處理具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)定周期短，適用于大批量樣品的快速檢測(cè)，而且有較高的穩(wěn)定性和滿意的提取效率。

14、4.132質(zhì)譜條件優(yōu)化以直接進(jìn)樣方式將每種100ng/mL的磺胺藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入離子源中，在正離子檢測(cè)方式下進(jìn)行母離子全掃描,得每種磺胺的分子離子峰，以每種磺胺的準(zhǔn)分子離子峰為母離子,進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，最后采集全掃描的二級(jí)質(zhì)譜圖，得碎片離子信息，再對(duì)得到每種磺胺的二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，使每種磺胺的定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度比例達(dá)最大時(shí)為最佳，得每種磺胺的二級(jí)質(zhì)譜圖。4.133色譜條件優(yōu)化圖1為標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物的總離子流圖。為使所有的磺胺類藥物達(dá)到滿意的分離度,分別考察含有014%乙酸或012%甲酸的10mmol/L乙酸銨溶液、U=011%的甲酸水溶液和甲醇、乙腈

15、、U=50%的甲醇-乙腈等有機(jī)溶液作流動(dòng)相時(shí)的分離效果。結(jié)果表明，以011%甲酸水溶液和甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，可使12種磺胺類藥物得到較好的分離。圖112種磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖FigiTICdiagramof12kindsofsulfonamide4.134線性范圍和檢出限將逐級(jí)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣25LL，測(cè)定結(jié)果經(jīng)線性回歸，線性范圍、回歸方程(y為峰面積;x為質(zhì)量濃度,Lg/L)、相關(guān)系數(shù)、檢出限(S/N=3)和定量限見(jiàn)表3。表312種磺胺類藥物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.3Regressionequation,linearityrange,conla

16、tivecofficient,detectionlimitof12kindsofsulfonamide磺胺線性范圍ngmL線性回歸方程相關(guān)系數(shù)r檢出限mg-kg-1定量限/rLsk.f11100y=2574.-1289.7a999s1033磺胺醋酰1-100y=225h3x430.0a999210331-100y=l095.3x349.4a99991033磺胺毗哽1-100y=3637.3x-2026.7a999710331-100y=4074,2x2026-2a99911033磺胺甲基喘喘1-100y=3388b2x-2334-8a99961033磺胺二甲基喘咗1100y=3357.4x-1

17、383-8a99931033磺胺劉甲氧疇唏1-100y=l813.lx-463.6a99961033磺胺甲氧噠嗪1-100y=6557.-421S-50.99991033磺.胺氯噠嗪1-100y=350h3x-2053-4(L999S1033磺胺甲基異噁呼1-100y=3935.5x-2668-50.99991033磺胺間二甲氧喘唏1100y=8192.4x-6005-60999710334.135方法的加標(biāo)回收率和精密度表4列出了加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表4化妝品中12種磺胺類藥物的加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)（n=6）Tabl4Recoveryof12kindsofsulfonamideincosmetics

18、amples磺胺添加量平均加標(biāo)回相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)/丄gkg-1收率/%偏差/%磺胺月米10090.27.41磺胺醋酰10093.56.15磺胺嗨喘10086.05.00磺胺毗喘10084.02.57磺胺嗟呼10080.13.45磺胺甲基嚅噪10082.74.34磺胺二甲基卩密噪10082.76.23磺胺對(duì)甲氧囉喘10090.75.25磺胺甲氧噠嗪10085.26.57磺胺氯噠嗪10090.66.13磺胺甲基異咚睦10087.37.10具體操作程序?yàn)?稱取空白樣品6份每份1g，分別添加質(zhì)量濃度為6”0Lg/mL的12種磺胺類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液011mL,按供試品溶液制備方法制備后，進(jìn)行測(cè)定。從表4中的回

19、收率及精密度數(shù)據(jù)可以看出，加標(biāo)回收率在8011%9315%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2157%7141%,滿足試驗(yàn)要求。5發(fā)展趨勢(shì)與已成熟的GCMS聯(lián)用技術(shù)相比較，LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)還處于發(fā)展階段。但LC-MS/MS所具備的一系列優(yōu)點(diǎn)，決定了它的應(yīng)用前景比GC-MS更為廣泛。在“接口”方面，API接口的成功應(yīng)用，使得液-質(zhì)聯(lián)用成為可能。在對(duì)大分子和小分子化合物分析中，展現(xiàn)了它作為通用接口的廣闊應(yīng)用前景。能夠?qū)崿F(xiàn)微徑HPLC與質(zhì)譜的聯(lián)用，這是近來(lái)的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)。在串聯(lián)質(zhì)譜方面，目前以四極桿串聯(lián)質(zhì)譜為主，它可進(jìn)行MS1和MS2操作（空間上）。離子阱質(zhì)譜和富利葉變換質(zhì)譜（FTICRMS）亦可完成多級(jí)串聯(lián)

20、質(zhì)譜分析（時(shí)間上），離子阱質(zhì)譜通過(guò)改變阱里射頻場(chǎng)最多可進(jìn)行10級(jí)MS操作，F(xiàn)T-ICR-MS通過(guò)離子回旋共振進(jìn)行多級(jí)MS操作。飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）作為第二個(gè)質(zhì)量分析器，由于其分辨率高、質(zhì)量范圍寬、掃描快和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，成為一個(gè)重要的發(fā)展方向。LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)愈來(lái)愈多地受到人們的重視，一些國(guó)際著名的分析儀器公司和研究機(jī)構(gòu)建立多個(gè)研究實(shí)驗(yàn)室參于研究開(kāi)發(fā)?？傊瑸閼?yīng)用目的而建立的LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)會(huì)越來(lái)越多，應(yīng)用研究課題也會(huì)越來(lái)越多。參考文獻(xiàn)：CaoHong,WangHao,LiuYanqin,YangHongmei,GuoQilei.Determinationof12kindso

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