藥品微生物檢驗(yàn)及無菌檢測(cè)

1、藥品微生物檢驗(yàn)及無菌檢測(cè)地址：北京市天壇西里2號(hào) 郵編：100050 蒲公英論壇：1藥品微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)及過程控制藥品因素環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢查破壞試驗(yàn)方法驗(yàn)證（氟康唑）過程控制2無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷3一、實(shí)驗(yàn)設(shè)施實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)操作環(huán)境關(guān)鍵設(shè)備對(duì)照培養(yǎng)基物 質(zhì) 保 障4（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)潔凈實(shí)驗(yàn)條件有效性：整體10000級(jí)、局部100級(jí)。安全性：保護(hù)樣品、人員和環(huán)境?？刹僮餍裕悍奖?、快捷、順暢。潔凈實(shí)驗(yàn)條件的維護(hù)、驗(yàn)證陽性菌實(shí)驗(yàn)室達(dá)到P2生物安全標(biāo)準(zhǔn)5（一）、實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)的管理與維護(hù)：1、屏障

2、系統(tǒng)的有效性 壓差、風(fēng)速、微粒、照度 （外包服務(wù)合同）2、清潔、靜態(tài)與動(dòng)態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫 酒精棉球分離微生物 新潔爾滅分離微生物 酸堿苯酚6環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：頭狀葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）藤黃微球菌（Micrococcusluteus）一般使用的陽性對(duì)照：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003銅綠假單胞菌（Pseudomona

3、s aeruginosa）CMCC(B)10104生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B)64941枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63501白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F)980037（二）、操作環(huán)境1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺(tái)8（二）、操作環(huán)境9（三）、關(guān)鍵設(shè)備 微生物檢查薄膜過濾儀 一次性薄膜過濾培養(yǎng)器應(yīng)急檢驗(yàn)用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器10（四）、對(duì)照培養(yǎng)基 培養(yǎng)基適用性（靈敏度）； 培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標(biāo)準(zhǔn)化）。對(duì)照培養(yǎng)基理化

4、評(píng)價(jià)（可控性）生物學(xué)評(píng)價(jià)（有效性）回收率比較MPN比較生長曲線比較生態(tài)評(píng)價(jià)某些CRS原則固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法11二、檢驗(yàn)程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷12二、檢驗(yàn)程序接受任務(wù)實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備樣品核對(duì)實(shí)驗(yàn)操作過程監(jiān)控培養(yǎng)觀察有效的結(jié)果物 質(zhì) 保 障13（一）、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備應(yīng)堅(jiān)持“平戰(zhàn)結(jié)合”，物質(zhì)準(zhǔn)備有備無患，應(yīng)隨時(shí)保證“來之能戰(zhàn)” 。尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實(shí)驗(yàn)器材等。14實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備無菌室專用酒精棉球制備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備場(chǎng)地清潔實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備臺(tái)面清潔15（二）、樣品核對(duì)盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程

5、中的完整性、安全性、有效性；仔細(xì)核對(duì)樣品及樣品資料，高度關(guān)注媒體公布樣品（問題樣品），同時(shí)盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)、比較分析；樣品外觀檢查、完整性檢查。16樣品外觀檢查欣弗樣品外觀檢查刺五加樣品外觀檢查雙黃連樣品完整性真空檢漏17（三）、實(shí)驗(yàn)操作不斷完善標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP），嚴(yán)格避免實(shí)驗(yàn)室污染。實(shí)驗(yàn)人員 培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)環(huán)境檢驗(yàn)結(jié)果待檢樣品原料 輔料 設(shè)備環(huán)境藥品（食品）人員 藥品食品生產(chǎn)過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)18三、結(jié)果判斷長菌與否分離鑒定溯源調(diào)查結(jié)果報(bào)告可靠的結(jié)論有效的結(jié)果物 質(zhì) 保 障19三、結(jié)果判斷 是不是

6、微生物？ 是什么微生物？ 微生物來自哪里？ 幾點(diǎn)思考 參見：FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗(yàn)潔凈室環(huán)境菌的相似性考 察藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（11）：11891194 判斷無菌檢查陽性結(jié)果有效性的實(shí)驗(yàn)探討藥物分析雜志， 2008， 28（05）：6671 201、長菌與否？渾不渾濁?物理變化、化學(xué)變化還是生物變化？一靠經(jīng)驗(yàn)二靠實(shí)驗(yàn)三靠嚴(yán)格程序控制避免干擾21是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁 物理變化？化學(xué)變化？生物學(xué)變化？（2）、平板上的菌落 瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層 菌落or藥渣？22菌落or藥渣？經(jīng)60Co射線大劑量照射再檢驗(yàn)延長培養(yǎng)時(shí)間到7天重新劃線培養(yǎng)鏡檢232、

7、分離鑒定（1）立即轉(zhuǎn)接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80保存；（3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；（4）如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應(yīng)增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應(yīng)進(jìn)一步鑒定，并逐一保藏。24是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD） 核酸鑒定（16sRNA、DNA） 253、溯源調(diào)查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株檢驗(yàn)過程監(jiān)控菌株環(huán)境菌（近期、遠(yuǎn)期）現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查收集菌株鑒定與相似性分析相結(jié)合傳統(tǒng)方法與新技術(shù)相結(jié)合不同方法的交叉驗(yàn)證26微生物來自哪里？

8、相似性分析 同源性分析 脈沖場(chǎng)電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR） 2728溯源性分析例1欣弗事件 頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcuscapitis ssp capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcuscohnii sspcohnii）藤黃微球菌（Micrococcusluteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）。監(jiān)測(cè)到的環(huán)境菌株29溯源性分析例2編號(hào)BD鑒定走廊1B.pumilus 走廊2M.lu

9、teus 走廊3/無菌室4C.urealyticum 無菌室5K.kristinae 無菌室6C.urealyticumC1524-FS.caprae C1524-BS.caprae C1525-B1-1S.warneri C1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidis C1526-F2S.haemolyticus菌株16sRN

10、A鑒定可信度C1524-FS. haemolyticus99%C1524-BS. haemolyticus98%C1526-F2S. haemolyticus100% 雙黃連注射液 利巴韋林注射液 FTIR相似性分析 DuPont RiboPrinter基因指紋分析30幾點(diǎn)思考（1）、怎樣才算是同一株菌？ 需要深入認(rèn)識(shí)微生物本身 微生物變異與保守的相對(duì)性； 分析方法的可變性與微生物本身的可變性；生物學(xué)先鋒琳恩馬古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果將一個(gè)特殊的質(zhì)粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會(huì)突然間變成克雷伯氏桿菌”。 31幾點(diǎn)思考（2）、什么是最適宜的技術(shù)？ 需要深入認(rèn)識(shí)分析微生物的

11、技術(shù)和手段 形態(tài)學(xué)分析與相似性分析（生化反應(yīng)譜、片段相似性、FTIR光譜相似性等），在權(quán)衡方法本身的邊界和微生物變異性邊界的基礎(chǔ)上，似乎更適合對(duì)親緣關(guān)系下一個(gè)否定的結(jié)論，即排除法，在這個(gè)意義上是否可以引入化學(xué)分析的3概念、精密度概念？ 324、幾點(diǎn)思考（2）、什么是最適宜的技術(shù)？ 16sRNA cDNA序列，需要研究，太保守不利于區(qū)分；變異率太高（高到普通傳代、培養(yǎng)難以控制）則沒有意義。但一般來說16sRNA cDNA序列水平具有確定意義，困難在于確定足夠長。 溯源分析不僅僅是鑒定到種，而是到株，對(duì)菌株的穩(wěn)定性認(rèn)識(shí)？與之相關(guān)的技術(shù)粗放性問題。 334、幾點(diǎn)思考（3）、怎樣下結(jié)論？ 分析的根本目的是要下一個(gè)結(jié)論 以檢驗(yàn)活動(dòng)為中心、以檢驗(yàn)過程為線索、以實(shí) 驗(yàn)事實(shí)為依據(jù)，根據(jù)所有信息的綜合分析能力。 對(duì)陽性檢出菌的技