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文檔簡(jiǎn)介
1、第一章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能構(gòu)型 :指在立體異構(gòu)體中取代原子或基團(tuán)在空間的取向;建;構(gòu)型的轉(zhuǎn)變涉與共價(jià)鍵的破裂和重構(gòu)象 conformation:指構(gòu)成分子的原子和基團(tuán)由于化學(xué)鍵的旋轉(zhuǎn)而形成在三維空間上不同的排布、走向;構(gòu)象的轉(zhuǎn)變不涉與共價(jià)鍵的破裂,僅涉與氫鍵、疏水鍵等次級(jí)鍵的變化;一級(jí)結(jié)構(gòu):指多肽鏈中氨基酸的排列次序;穩(wěn)固因素:肽鍵二級(jí)結(jié)構(gòu) :多肽鏈的某一段肽鏈中,鄰近氨基酸殘基之間,通過(guò)氫鍵形成的有規(guī)那么重復(fù)的 - 螺旋和 - 折疊、局部有規(guī)那么的- 轉(zhuǎn)角和 環(huán)或無(wú)序結(jié)構(gòu)的一種局部構(gòu)象;二面角 構(gòu)象角 連結(jié)兩個(gè)相鄰肽平面的C產(chǎn)生的角;二面角打算了兩個(gè)相鄰肽平面的空間相對(duì)位置;二級(jí)結(jié)構(gòu)與一級(jí)結(jié)
2、構(gòu)的關(guān)系:各種氨基酸殘基在不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)中顯現(xiàn)的頻率不同 a. 形成 - 螺旋才能強(qiáng)的氨基酸有:Glu、Met、Ala 、Leu b. 形成 - 折疊才能強(qiáng)的氨基酸有:Val 、Ile 、Tyrc. 形成 - 轉(zhuǎn)角才能強(qiáng)的氨基酸有:Pro 、 Gly 、Asn、Asp、Ser;此外,多肽鏈中假設(shè)存在連續(xù)酸性或堿性的氨基酸殘基時(shí),因同電相斥也影響構(gòu)象的形成,所以, 多肽鏈的 R側(cè)鏈的位置、大小、極性、荷電情形等,最終打算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成;超二級(jí)結(jié)構(gòu) :相鄰的幾個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用形成有規(guī)那么的組合體,是特別的序列或結(jié)構(gòu)的根本組成單元,又稱為基序或模體; EF hand;Leucine zipp
3、er 、 ;結(jié)構(gòu)域: 超二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步組合折疊成半獨(dú)立嚴(yán)密的球狀類型:1, 平行 / 型 2, 反平行 - 型 3, 全 - 型 4, 小的不規(guī)那么結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu) :在二級(jí)結(jié)構(gòu), 超二級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域根底上,一級(jí)結(jié)構(gòu)相隔較遠(yuǎn)的氨基酸殘基以次級(jí)鍵相連, 回旋折疊成球狀,形成包括主鏈和側(cè)鏈在內(nèi)全部原子和基團(tuán)的特定空間排布;穩(wěn)定因素:側(cè)鏈 R 基團(tuán)之間相互作用形成的各種非共價(jià)鍵,包括疏水鍵、氫鍵、離子鍵和 X德華力等;四級(jí)結(jié)構(gòu) :多亞基蛋白的各亞基的相對(duì)空間排布與亞基間的相互作用,維系力主要是疏水作用力、氫鍵和離子鍵等次級(jí)鍵;HB 變性 denaturation:物理化學(xué)因素使蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)變化 ,
4、生物學(xué)功能降低或丟失,其實(shí)質(zhì)是破壞維系蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的次級(jí)鍵,但不涉與肽鍵的斷裂;復(fù)性 :將蛋白質(zhì)從結(jié)構(gòu)不規(guī)那么、無(wú)活性的狀態(tài),復(fù)原到有唯獨(dú)立體結(jié)構(gòu)、有生物活性的狀態(tài)的過(guò)程;同源蛋白質(zhì) homologus protein 先;執(zhí)行同一種功能的蛋白質(zhì)在進(jìn)化過(guò)程中可能來(lái)自同一祖分子病 結(jié)構(gòu)反常鐮刀狀細(xì)胞貧血; 分子削減或缺失蠶豆病構(gòu)象病 折疊錯(cuò)誤導(dǎo)至功能轉(zhuǎn)變酵母雙雜交系統(tǒng) 其原理是當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后,誘餌蛋白結(jié)合于報(bào)道基因的啟動(dòng)子,啟動(dòng)報(bào)道基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) . 其次章 糖蛋白、蛋白聚糖與脂蛋白糖蛋白 :蛋白質(zhì)與糖類構(gòu)成的共價(jià)復(fù)合物,含糖類較少,含糖量一般為 2%50%;蛋白聚糖 :
5、蛋白質(zhì)與糖類構(gòu)成的共價(jià)復(fù)合物,含糖類較多,含糖量一般為 50%90%;血脂 :血漿中所含脂類統(tǒng)稱血脂,包括甘油三酯 TG,磷脂 PL, 膽固醇 Ch 與游離脂酸 FFA;血漿 中 血 脂 與 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 合 以 脂 蛋 白 lipoprotein 的 形 式 進(jìn) 展 運(yùn) 輸 ; 分 為 :CM,VLDL,IDL,LDL,HDL;脂蛋白中的蛋白質(zhì)稱為 載脂蛋白 apolipoprotein;CM:來(lái)源于食物脂肪, 顆粒最大, 密度最低, 含 TG最多, 蛋白質(zhì)含量最少,主要為 apo B48.DOC. 主要含有外源性甘油三酯,是運(yùn)輸外源性甘油三酯與膽固醇的主要形式;正常人血漿中的乳糜微??崭?/p>
6、 12 小時(shí)后就被完全去除,不是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危急因素,但簡(jiǎn)潔誘發(fā)胰腺炎. VLDL:含 TG也多,但蛋白質(zhì)含量高于CM,主要為 apo B100. 是運(yùn)輸內(nèi)源性甘油三酯的主要形式;正常人極低密度脂蛋白大局部代謝變成低密度脂蛋白;這類脂蛋白由于攜帶膽固醇數(shù)量相對(duì)較少,且它們的顆粒相對(duì)較大,不易透過(guò)血管內(nèi)膜,因此,正常的極低密度脂蛋白沒(méi)有致動(dòng)脈硬化作用,像乳糜微粒一樣也不是冠心病的主要危急因素,極低密度脂蛋白代謝產(chǎn)生的中密度脂蛋白具有致動(dòng)脈硬化作用;VLDL 在肝臟合成,利用來(lái)自脂庫(kù)的脂肪酸作為合成材料,其中膽固醇來(lái)自 CM殘粒與肝自身合成的局部;IDL:VLDL向 LDL轉(zhuǎn)化過(guò)程中的中間產(chǎn)
7、物,與 VLDL相比, Ch含量已明顯增加 ,apoB100,apoC . 含膽固醇與其酯最多,幾乎只含 apo B100. LDL: 是富含膽固醇的脂蛋白,其膽固醇主要來(lái)自從CE轉(zhuǎn)運(yùn)的高密度脂蛋白中的膽固醇;目前認(rèn)為血漿中 LDL 的來(lái)源有兩條途徑:主要途徑是由 VLDL異化代謝轉(zhuǎn)變而來(lái);次要途徑是肝合成后直接分泌到血液中;LDL 的降解是經(jīng) LDL 受體途徑進(jìn)展代謝,當(dāng)?shù)兔芏戎鞍走^(guò)量時(shí), 它攜帶的膽固醇便積存在動(dòng)脈壁上,久了簡(jiǎn)潔引起動(dòng)脈硬化;因此低密度脂蛋白被稱為“ 壞的膽固醇;Lpa : 脂質(zhì)成分類似于LDL, 但多含一分子apoa, 直接由肝臟產(chǎn)生, 不能轉(zhuǎn)化為其他種類的脂蛋白 .
8、HDL:顆粒最小 , 蛋白質(zhì)含量最多,apo 主要為 apoAI 與 apoAII. 由于可輸出膽固醇促進(jìn)膽固醇的代謝,所以為動(dòng)脈硬化預(yù)防因子;HDL主要由肝和小腸合成;肝合成的新生HDL以磷脂和 ApoA為主;HDL可將蓄積于末梢組織的游離膽固醇與血液循環(huán)中脂蛋白或與某些大分子結(jié)合而運(yùn)輸?shù)礁鹘M織細(xì)胞,主要是肝臟;實(shí)際上是膽固醇逆轉(zhuǎn)RCT,RCT促進(jìn)組織細(xì)胞內(nèi)膽固醇的去除, 維護(hù)細(xì)胞內(nèi)膽固醇量的相對(duì)衡定,從而限制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生開(kāi)展,起到抗動(dòng)脈粥樣硬化作用;脂蛋白結(jié)構(gòu) : 甘油三酯與膽固醇酯構(gòu)成內(nèi)核; 載脂蛋白、磷脂與膽固醇等兼性分子以單分子層借助其非極性的疏水基團(tuán)與內(nèi)核相連,而極性的親水基
9、團(tuán)位于外表 . 脂蛋白的臨床意義 :CM可能與 AS有關(guān); VLDL水平上升是 CHD的危急因子 IDL 始終被認(rèn)為具有致 AS作用; LDL 是首要的致 AS因子;經(jīng)過(guò)氧化或其他化學(xué)修飾后的 LDL, 具有更強(qiáng)的致AS作用; HDL被認(rèn)為是一種抗動(dòng)脈粥樣硬化的血漿脂蛋白, 是冠心病的愛(ài)護(hù)因子;脂蛋白受體 :一類位于細(xì)胞膜上的糖蛋白,它們能以高親和性的方式與其相應(yīng)的脂蛋白配體相互作用, 介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)脂蛋白的攝取和代謝,從而進(jìn)一步調(diào)劑血漿脂蛋白和血脂的水平;功能 a. 參與脂蛋白代謝 b. 參與視黃酸和類固醇的內(nèi)吞性攝取 , 如 Megalin c. 參與體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)的傳遞,如 LRP、VLDL-
10、R 與 apoE-R2;LDL 受體家族、清道夫受體家族、脂解激活受體;LDL在內(nèi)小體的酸性環(huán)境中與LDL 受體別離 1. 含受體局部的小泡成再循環(huán)小泡,又回到細(xì)胞外表 LDL 受體的再循環(huán)途徑 2. LDL 被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w,并被溶酶體內(nèi)的酶類分解,載脂蛋白主要為 apoB100降解成氨基酸,膽固醇酯那么被酸性酯酶水解為游離膽固醇;LDL受體的功能: 1 結(jié)合 LDL或其它含 apoB100 或 apoE 的脂蛋白,內(nèi)吞入細(xì)胞以獲得脂類,主要為膽固醇 2 50% LDL在肝臟經(jīng) LDL受體途徑降解 3. 影響 LDL的生成速率以與 VLDL代謝,并能在 CM代謝中發(fā)揮作用 LDL R VLDL
11、R 3 LDL receptor related protein LRP4.apoE R-2 血漿中的 LDL 仍可被修飾,修飾的 LDL 如氧化修飾 LDL ox-LDL 可被去除細(xì)胞;即單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞去除;這兩類細(xì)胞膜外表具有清道夫受體scavenger receptor, SR,攝取去除血漿中的修飾LDL;ox-LDL 引起動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)理:沉積在動(dòng)脈粥樣斑塊上的脂質(zhì)是來(lái)源于血漿中低密度脂蛋白 LDL ;膽固醇與其酯在血管壁內(nèi)的集合很可能與兩條途徑有關(guān): 一是依靠?jī)?nèi)皮細(xì)胞 和DOC. 血管壁內(nèi)的其他細(xì)胞 膜上的特異性受體進(jìn)展的主動(dòng)攝取; 二是經(jīng)過(guò)非受體途徑被
12、動(dòng)性進(jìn)入, 如在嚴(yán)峻內(nèi)皮損耗時(shí);血管壁內(nèi)和動(dòng)脈粥樣硬化損耗處的全部主要細(xì)胞都能氧化LDL, 產(chǎn)生氧化型 LDLOx-LDL ;但是 , 在動(dòng)脈樣硬化的早期階段, 內(nèi)皮細(xì)胞對(duì) LDL 的輕度氧化可能是至關(guān)重要的;輕度氧化的LDL 或微小修飾的LDLmmLDL在引起單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞集合方面具有啟動(dòng)因子的作用;巨噬細(xì)胞吞噬了大量的Ox-LDL 后就衍變成泡沫細(xì)胞,巨噬細(xì)胞或泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)飽和后, 無(wú)論破裂與否 , 都可釋放大量的活性物質(zhì), 加速病變的進(jìn)展; 泡沫細(xì)胞逐步增多并融合,形成脂質(zhì)條紋,繼而開(kāi)展為成熟的粥樣斑塊;Lpa 的組成 1. 脂質(zhì)成分與 apoa 以二硫鍵相連LDL 相像 含量
13、:TG 高于 LDL,Ch 低于 LDL2.蛋白質(zhì) apoB100 和Lpa 致 As 的機(jī)制 Lpa 與纖溶酶原結(jié)構(gòu)同源1. Lpa 與纖溶酶原競(jìng)爭(zhēng)底物的結(jié)合部位 Lpa 中的 apoa 與纖溶酶原競(jìng)爭(zhēng)同一底物纖維蛋白或纖維蛋白原,但由于apoa 不具備酶的活性,導(dǎo)致其不能溶解或分解與其結(jié)合的纖維蛋白,相反它仍促進(jìn)或有利于纖維蛋白冷靜于血管壁,參與血栓形成,繼而啟動(dòng) As 的發(fā)生和開(kāi)展;2. Lpa 競(jìng)爭(zhēng)性抑制纖溶酶原與細(xì)胞纖溶酶原受體的結(jié)合纖溶酶原受體的主要作用是加速纖溶酶原的活化,促進(jìn)血栓的溶解,愛(ài)護(hù)纖溶酶不被抑制;但由于Lpa 的分子結(jié)構(gòu)與纖溶酶原極為相像, 因此它能與纖溶酶原競(jìng)爭(zhēng)纖溶
14、酶原受體,從而抑制血栓的溶解,促進(jìn)血栓的形成;非編碼 RNANon-Coding RNA ,指的是不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA,如 tRNA, rRNA 等,這些RNA不被翻譯成蛋白質(zhì),但是其中有一些會(huì)參與蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程;miRNA是在真核生物中發(fā)覺(jué)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA,其大小長(zhǎng)約 2025個(gè)核苷酸;成熟的 miRNAs是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的,隨后組裝進(jìn) RNA誘導(dǎo)的緘默復(fù)合體,通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶 mRNA,并依據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)緘默復(fù)合體降解靶 mRNA或者阻遏靶 mRNA的翻譯;第九章 染色質(zhì)與基因表達(dá)調(diào)控表觀遺傳學(xué) :是討論表
15、觀遺傳變異的遺傳學(xué)分支學(xué)科;表觀遺傳變異是指,在基因的 DNA序列沒(méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)變的情形下,基因功能發(fā)生了可遺傳的變化,并最終導(dǎo)致了表型的變化;它是不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的遺傳;表觀遺傳學(xué)的意義:DNA或相關(guān)蛋白的修飾, ,而不是 DNA序列的變化來(lái)打算表型;常染色質(zhì)堿性染料著色淺而均一,DNA 復(fù)制較早,對(duì)核酸酶敏銳,富含基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)劑蛋白和乙酰組蛋白,核小體陣列不規(guī)那么,壓縮程度低;異染色質(zhì)堿性染料著色深而不均,DNA 復(fù)制晚而慢,對(duì)核酸酶不敏銳,所含基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白甚少,富含高度重復(fù)序列,核小體陣列規(guī)那么,高度壓縮;重建復(fù)合物 :為多蛋白巨型分子,別離純化時(shí)輔基或結(jié)合的蛋白質(zhì)共沉淀;具解旋酶
16、基序或結(jié)構(gòu)域, 能直接在 DNA模板區(qū)引入負(fù)超螺旋,對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)極具影響;有 ATP依靠性 ATPase活性, 靠 ATP供能而調(diào)劑核小體結(jié)構(gòu);有些亞基具有組蛋白修飾酶活性,體外促核小體重定位或解體;無(wú)論基因復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)劑,均需染色質(zhì)重建復(fù)合物不斷沿著核小體 DNA滑動(dòng),實(shí)施其對(duì)核小體減壓縮 / 壓縮和靶基因 DNA元件開(kāi) / 關(guān)的調(diào)控, 以應(yīng)答內(nèi)外環(huán)境各種信號(hào)與其需求;核小體 :是真核染色質(zhì)的根本結(jié)構(gòu)單位,包含核心顆粒、接頭 白;DNA和組蛋白 H1 以與非組蛋組蛋白密碼 :核小體核心組蛋白 N-端尾區(qū),具細(xì)胞信息潛在的儲(chǔ)存功能,是供應(yīng)表型遺傳信息的豐富來(lái)源, 此信息可傳遞至子代;尾區(qū)
17、位點(diǎn)修飾與其組合,構(gòu)成一套限定染色質(zhì)局部轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的密碼;DOC. 染色質(zhì)化學(xué)修飾與基因表達(dá)核染色質(zhì)化學(xué)修飾是指其組成DNA、RNA、組蛋白和非組蛋白分子參與 / 去除某個(gè)化學(xué)基團(tuán)的反響;1. 染色質(zhì) DNA甲基化 / 去甲基化,甲基化促使基因緘默,對(duì)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、基因表達(dá)等調(diào)劑, 表型遺傳和腫瘤發(fā)生都具有非常重要的意義;惡性腫瘤伴DNA甲基化總水平降低、多種癌基因伴低甲基化與其轉(zhuǎn)錄激活,或多種抑癌基因伴高甲基化與其轉(zhuǎn)錄抑制;2. 染色質(zhì)組蛋白甲基化/ 去甲基化主要發(fā)生在H3H4賴氨酸殘基上,甲基化促進(jìn)異染色質(zhì)的形成;3. 染色質(zhì)組蛋白乙?;虮磉_(dá)/ 去乙?;蜿P(guān)閉 HAT/HD
18、AC 4. 染色質(zhì)磷酸化 / 去磷酸化 主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸羥基上,與負(fù)電荷磷酸基團(tuán)結(jié)合,誘導(dǎo)分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變,增加分子間排斥力或吸引力,產(chǎn)生特有的生物學(xué)效應(yīng);5. 染色質(zhì)泛素化 / 去泛素化 影響蛋白質(zhì) / 蛋白質(zhì)相互作用、DNA定位、轉(zhuǎn)錄激活 / 阻遏、降解/ 穩(wěn)固等;很多重要靶基因上游的調(diào)劑蛋白具泛素連接酶活性,特別很多真核 RNA聚合酶相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性受 E3 泛素化和 / 或蛋白體降解的調(diào)控;順式作用元件 :凡能激活 / 阻遏基因轉(zhuǎn)錄的 DNA序列;啟動(dòng)子 :位于基因編碼區(qū)上游并為 RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的 DNA序列;增強(qiáng)子 :能加強(qiáng)其上游或下游基因轉(zhuǎn)錄的 DN
19、A序列;終止子 :基因編碼區(qū)下游能促使 RNAP識(shí)別并終止 RNA合成的 DNA序列;緘默子 :能抑制上游或下游基因轉(zhuǎn)錄的 DNA序列;隔離子 :在真核基因組內(nèi)建立獨(dú)立轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域的調(diào)劑元件;反式作用因子 :凡直接或間接與順式作用元件相互作用并影響基因表達(dá)的調(diào)劑蛋白;轉(zhuǎn)錄因子 :與核心啟動(dòng)子特異結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的調(diào)劑蛋白;第六章 細(xì)胞信號(hào)傳遞細(xì)胞信號(hào)傳遞 :信息物質(zhì) 分子通過(guò)一系列中間環(huán)節(jié)把信號(hào)傳遞到靶細(xì)胞內(nèi),使靶細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)細(xì)胞信號(hào)傳遞的根本過(guò)程:特定細(xì)胞合成并分泌信號(hào)分子信號(hào)分子通過(guò)擴(kuò)散或血循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞 靶細(xì)胞的受體識(shí)別并結(jié)合信號(hào) 胞內(nèi)生物學(xué)效應(yīng) 通過(guò)一系列的化學(xué)反響將信號(hào)傳遞到靶
20、細(xì)細(xì)胞間的信號(hào)分子,又稱第一信使,細(xì)胞分泌的具有調(diào)劑靶細(xì)胞生命活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì);分類: 1. 激素:內(nèi)分泌信號(hào) endocrine signal 特點(diǎn)由內(nèi)分泌細(xì)胞分泌;通過(guò)血循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞 作用時(shí)間較長(zhǎng) 2. 局部化學(xué)介質(zhì):旁分泌信號(hào) paracrine signal 特點(diǎn):由特定細(xì)胞分泌通過(guò)擴(kuò)散作用于鄰近的靶細(xì)胞作用時(shí)間較短 3. 神經(jīng)遞質(zhì): 突觸分泌信號(hào) synaptic signal特點(diǎn):由神經(jīng)元突觸前細(xì)胞分泌通過(guò)突觸間隙到達(dá)突觸后細(xì)胞作用時(shí)間較短 4. 氣體信號(hào)特點(diǎn) 直接穿越細(xì)胞膜進(jìn)入靶細(xì)胞 直接轉(zhuǎn)變效應(yīng)酶的活性 舉例: NO, CO 細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子:第一信使與受體結(jié)合后在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的
21、傳遞信號(hào)的化學(xué)物質(zhì);受體 Receptor : 是細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能特異識(shí)別生物活性分子并與之結(jié)合,進(jìn)而引起生物學(xué)效應(yīng)的特別蛋白質(zhì);配體 Ligand : 能與受體特異結(jié)合的生物活性分子,如:細(xì)胞間信號(hào)分子、藥物、維生素、毒物;一. 膜受體 1. 配體門控離子通道 配體:神經(jīng)遞質(zhì) 舉例:乙酰膽堿受體 2.G 蛋白偶聯(lián)受體 GPCR 此類受體承擔(dān)的信息 需 G蛋白的轉(zhuǎn)換才能傳遞到靶細(xì)胞內(nèi),即與 G蛋白偶聯(lián);單鏈糖蛋白 , 七個(gè)跨膜 螺旋 N 端在細(xì)胞膜外側(cè),C端在細(xì)胞內(nèi)側(cè),三個(gè)細(xì)胞外環(huán),三個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán); N 端常被糖基化 C 端常被棕櫚?;?配體結(jié)合域胞內(nèi)域與 G蛋白偶聯(lián)DOC. 3. 單個(gè)跨膜螺
22、旋受體受體酪氨酸蛋白激酶RTKs/TPKs 非酪氨酸蛋白激酶受體 Non-TPK receptors 不具有 TPK活性,與酪氨酸蛋白激酶偶聯(lián)功能: 細(xì)胞分化、增殖和癌變二、胞內(nèi)受體胞內(nèi)受體通常為反式作用因子trans-acting factors L- R 順式作用原件調(diào)劑基因轉(zhuǎn)錄配體:類固醇激素,甲狀腺素受 體 作 用 特 點(diǎn) : 高 特 異 性 High specificity 高 親 和 力 High affinity 可 飽 和 性Saturability 可逆性 Reversibility 可調(diào)劑性G蛋白 是鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白 guanine nucleotide binding pr
23、otein 的簡(jiǎn)稱;與 GDP/GTP可逆結(jié)合 位于細(xì)胞膜胞漿面的外周蛋白 屬于 GTPase超家族 雜三聚體 : 活性亞基,結(jié)合GDP/GTP,結(jié)合受體 GTPase 活性GTPGDP + Pi : 7個(gè) -sheet : 2個(gè) -helix 脫落構(gòu)象 Inactive: -GDP ; Active: -GTP, 信號(hào)傳遞途徑 cAMP-PKA途徑 第一信使 R: GPCRs AC腺苷酸環(huán)化酶其次信使:cAMP PKA蛋白 激酶 A, 又稱為 cAMP依靠性蛋白激酶,變構(gòu)酶- 四聚體 R2C2 R2C2: inactive R 自身抑制的結(jié)構(gòu)域占據(jù)了 C上底物結(jié)合部位4 cAMP + R2C
24、2inactive R 2.4 cAMP + 2C active生物學(xué)效應(yīng)磷酸化下游靶蛋白調(diào)劑代謝的關(guān)鍵酶/ 調(diào)劑轉(zhuǎn)錄的蛋白因子的Ser/Thr 殘基,轉(zhuǎn)變靶蛋白的活性,從而調(diào)劑細(xì)胞的物質(zhì)代謝和基因表達(dá);磷蛋白磷酸酶 Protein Phosphatase, PP 使被磷酸化的蛋白質(zhì)脫去無(wú)機(jī)磷酸鹽,回復(fù)根本狀態(tài);可被 cAMP抑制;PKA調(diào)劑基因表達(dá)順式作用元件 : cAMP 應(yīng)答元件 cAMP response element, CRE TGACGTCA 反 式 作 用 因 子 : cAMP 應(yīng) 答 元 件 結(jié) 合 蛋 白 cAMP response element binding prot
25、ein,CREBCREB 結(jié)合蛋白 CREB-binding protein,CBP PKA 的C 亞 基 進(jìn) 入 細(xì) 胞 核 磷 酸 化CREB 的Ser/Thr殘 基 p-CREB-CRE CBP-p-CREB-CRE 調(diào)劑基因的轉(zhuǎn)錄Ca 2+-PKC 途徑 第一信使 G 蛋白偶聯(lián)受體PLC 磷脂酶 CPIP 2 IP 3+DAG其次信使: IP3、DAG、Ca 2+ PKC 鈣依靠性蛋白激酶 Ca 2+ -dependent protien kinase, PKC或蛋白激酶 C,調(diào)劑代謝:磷酸化靶蛋白的 Ser/Thr 殘基靶蛋白:膜受體,膜蛋白和多種酶舉例 PKC磷酸化質(zhì)膜的 Ca 2
26、+通道 Ca 2+內(nèi)流胞漿內(nèi) Ca 2+ ; PKC磷酸化肌漿網(wǎng)的Ca 2+-ATP 酶 Ca 2+進(jìn)入肌漿網(wǎng)胞漿內(nèi) Ca 2+ 調(diào)劑基因表達(dá): 早期反響: 磷酸化立早基因的反式作用因子促進(jìn)立早基因的表達(dá)早期反響;立早基因 : 細(xì)胞原癌基因 c-fos, AP1/c-jun第三信使 : c-fos蛋白 , AP1/c-jun蛋白晚期反響:第三信使磷酸化晚期反響基因活化晚期反響生物學(xué)效應(yīng): IP3: 從膜上擴(kuò)散到胞漿中與ER 的受體結(jié)合鈣通道打開(kāi)胞漿內(nèi)Ca 2+ ; DAG: PS, Ca 2+的幫助下,激活 PKC cGMP-PKG途徑 第一信使 : 心房肽、鳥(niǎo)苷素、NO GC 鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶其
27、次信使:cGMP PKG生物學(xué)效應(yīng)Ca 2+-CaM途徑 第一信使受體其次信使:Ca 2+ CaM生物學(xué)效應(yīng)四個(gè) Ca結(jié)合區(qū),與 Ca結(jié)合后,即引起構(gòu)象轉(zhuǎn)變從而引起其與受體蛋白的作用而表現(xiàn) CaM的生物活性;肌球蛋白輕鏈激酶DOC. 核因子 B nuclear factor- B NF- B 由 Rel 家族成員的同源 / 雜二聚體組成NF- B 的活化機(jī)制 在胞質(zhì)中與其抑制蛋白 I B 結(jié)合,并與 PKA的催化亞基結(jié)合,呈不具活性狀態(tài); 很多刺激因子如細(xì)胞因子,氧自由基等均可使其活化;在這些因子作用下,I B激酶 IKK激活,使抑制蛋白磷酸化,后經(jīng)泛素化被降解;同時(shí)PKAc使 NF- B 亞
28、基磷酸化,解離,使 NF- B 活化,轉(zhuǎn)移入胞核,并與 DNA的 B 反響元件結(jié)合,從而調(diào)劑特異基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá);受 NF- B 調(diào)控的靶基因:TNF, IL, CSF, 免疫受體,粘附因子,趨化因子,急性期蛋白,病毒,轉(zhuǎn)錄調(diào)劑子,抗凋亡因子等功能:炎癥反響、應(yīng)激反響、細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和細(xì)胞凋亡第十章基因克隆DNA片段連接在載體如細(xì)菌質(zhì)?;虿《綝NA分子上去, 即在基因克隆 :將任何生物包括人的體外重組,隨后引入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞進(jìn)展無(wú)性繁衍的過(guò)程;常用工具酶:限制性內(nèi)切酶RE是一類特異性水解雙鏈 DNA的磷酸二酯酶;DNA聚合酶:催化體外 DNA合成;RNA聚合酶:轉(zhuǎn)錄酶,體外 DNA轉(zhuǎn)錄成 R
29、NA所必需;反轉(zhuǎn)錄酶:催化 RNA模板反轉(zhuǎn)錄生成 DNA產(chǎn)物;DNA連接酶:將兩段 DNA分子拼接的酶叫 DNA連接酶;載體條件: 1 必需有自身的復(fù)制子,能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主地進(jìn)展復(fù)制,并能使靶 DNA片段同步擴(kuò)增; 2 載體分子上必需有限制性內(nèi)切酶點(diǎn),以供外源 DNA插入, 具有多種酶的單一位點(diǎn), 給予載體在使用上有更大的敏捷性;3 應(yīng)具有可供挑選的遺傳標(biāo)志,以便于陽(yáng)性重組體的挑選; 4 載體分子本身應(yīng)盡量小,可容納較大的外源 DNA片段, 并具有拷貝數(shù)高、易與宿主 DNA別離與抗剪切力強(qiáng)等特點(diǎn);子、前導(dǎo)次序、增強(qiáng)子等調(diào)控元件;5 對(duì)于表達(dá)型載體仍應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)基因克隆 是
30、用別離純化或人工合成的基因DNA片段,在體外與載體DNA連接,將重組DNA分子,導(dǎo)入宿主細(xì)胞,經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、挑選、鑒定等程序,獲得含重組 一、別離或合成外源基因DNA的活細(xì)胞;從基因組文庫(kù)中挑選;從 cDNA文庫(kù)中挑選;人工合成目的基因;PCR擴(kuò)增目的基因二、目的基因與載體重組 特定靶基因插入載體 DNA,經(jīng) DNA連接酶催化形成嵌合 DNA;三、基因?qū)敕?體外連接的重組 DNA分子導(dǎo)入相宜的受體細(xì)胞才能大量復(fù)制、增殖和表達(dá);轉(zhuǎn)化:質(zhì)粒 DNA與其重組體導(dǎo)入細(xì)菌;轉(zhuǎn)染:病毒與其重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞;轉(zhuǎn)導(dǎo):噬菌體與其重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞;氯化鈣法;電穿孔法;轉(zhuǎn)染試劑法;顯微注射法四、重組體的挑選與鑒定
31、從轉(zhuǎn)化菌落中,挑選含有陽(yáng)性重組體的菌落并鑒定重組體的正確性,通過(guò)細(xì)胞培育,重組體的擴(kuò)增, 獲得足量靶基因片段,供進(jìn)一步討論該基因與其表達(dá)產(chǎn)物的機(jī)構(gòu)、功能;第十一章基因突變?nèi)笔Щ蜣D(zhuǎn)變而引起的基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變,進(jìn)而基因突變 :基因組 DNA分子中發(fā)生堿基的增加、引起遺傳表型的轉(zhuǎn)變;突變分類:1. 堿基轉(zhuǎn)變:點(diǎn)突變 DNA 被化學(xué)修飾或復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)配,使一個(gè)堿基變成另一個(gè)堿基;堿基插入突變 DNA鏈中插入 1 個(gè)或多個(gè)堿基轉(zhuǎn)座子 Tn,突變后可引起 DNA序列閱讀框架轉(zhuǎn)變DOC. 堿基缺失突變 DNA 鏈中 1 個(gè)或多個(gè)堿基發(fā)生丟失,突變后可引起 DNA序列閱讀框架轉(zhuǎn)變2. 密碼效應(yīng):同義突變:堿基被
32、替代后沒(méi)有密碼子轉(zhuǎn)變,其產(chǎn)物AA序列也無(wú)變化;錯(cuò)義突變:堿基序列的轉(zhuǎn)變引起 AA序列轉(zhuǎn)變;無(wú)義突變:某個(gè)堿基轉(zhuǎn)變使某個(gè)AA的密碼子成為蛋白質(zhì)合成的終止密碼子;3表型特點(diǎn) : 外形突變 : 突變主要影響生物體的外在可見(jiàn)的外形結(jié)構(gòu),故又稱可見(jiàn)突變;如外形、大小、色澤等的轉(zhuǎn)變;生化突變 : 突變影響生物的代謝過(guò)程;導(dǎo)致一個(gè)特定的生化功能的轉(zhuǎn)變或丟失;致死突變 : 影響生物體的生活力,導(dǎo)致個(gè)體死亡的一類突變;4發(fā)生突變的細(xì)胞分類:體細(xì)胞突變: 在保持分裂的身體組織的一個(gè)細(xì)胞發(fā)生突變,這個(gè)細(xì)胞便成為一群一樣突變細(xì)胞的祖先;在發(fā)育過(guò)程中, 體細(xì)胞突變大事發(fā)生的愈早,對(duì)表型的影響就愈大;體細(xì)胞突變一般不能遺
33、傳給后代;生殖細(xì)胞突變:生殖細(xì)胞突變發(fā)生在種系germ line中;假如突變的性細(xì)胞參與受精過(guò)程,那么突變基因就會(huì)傳給下一代;基因突變特點(diǎn) : 一 突變的平行性、重演性和可逆性平行性 是指親緣關(guān)系相近的物種因遺傳根底較近似而發(fā)生相像基因突變的現(xiàn)象;重演性 一樣的基因突變可以在同種生物的不同個(gè)體間重復(fù)發(fā)生,稱為重演性;可逆性 基因突變的發(fā)生方向是可逆的;正突變 forward mutation:顯性基因 A 隱性基因 a ;反突變 reverse mutation:隱性基因 a 顯性基因 A ; 二 突變的多方向性與復(fù)等位基因突變的多方向性:指基因突變可以多方向發(fā)生,即基因內(nèi)部多個(gè)突變部位分別轉(zhuǎn)
34、變后會(huì)產(chǎn)生多種等位基因形式;復(fù)等位基因 multiple allele:位于同一基因位點(diǎn)上的多種等位基因;在二倍體與異源多倍體中, 同一位點(diǎn)只能有一對(duì)基因,最多存在兩種等位基因形式;因此復(fù)等位基因的各種形式會(huì)存在于生物群體的不同個(gè)體中 三 隨機(jī)性生物個(gè)體發(fā)育的任何時(shí)期體細(xì)胞突變不遺傳給后代生殖細(xì)胞突變遺傳給后代 四 廣泛性和有害性多數(shù)定點(diǎn)突變技術(shù): 在體外條件下定向誘發(fā)突變,分析這些突變的表型;各種核酸酶和突變劑制造突變技術(shù)制造點(diǎn)特異突變,然后導(dǎo)入生物體內(nèi),觀看并寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變:利用化學(xué)合成的含義突變堿基的寡核苷酸片段作引物,啟動(dòng)單鏈 DNA分子進(jìn)展復(fù)制, 隨后這段寡核苷酸引物便成為新
35、合成 DNA子鏈的一個(gè)組成局部,新生成的鏈便已具有突變的堿基序列;為了使靶基因的特點(diǎn)位點(diǎn)發(fā)生突變,所設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物的序列除了所需的突變堿基外,其余的序列那么與靶基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補(bǔ);Kunkel 定點(diǎn)誘變法 :通過(guò)篩除含尿嘧啶DNA模板鏈; 在 dut-,ung-雙缺陷的大腸桿菌中培育重組 M13噬菌體,制備的單鏈模板DNA含有很多 U堿基, DNA聚合酶, dNTP,DNA連接酶,合成的新鏈那么不含U而含 T,轉(zhuǎn)染野生型大腸桿菌ung + 結(jié)果含 U的模板在尿嘧啶脫糖苷酶的作用下發(fā)生鏈的斷裂而被破壞;硫代磷核苷酸誘變法:限制性核酸內(nèi)切酶 Ava, Ava, Ban, Hind,
36、Nci, Pst,Pvu等不能切割有硫代磷核苷酸衍生物取代正常核苷酸形成的 DNA;用硫代磷核苷酸 , 在DOC. DNA聚合酶催化和DNA連接酶作用下,形成異源dsDNA分子,再用Nci消化該異源dsDNA分子,可獲的高效率的定點(diǎn)突變分子;PCR定點(diǎn)突變重疊延長(zhǎng) PCR誘變:用 PCR法各擴(kuò)增兩條帶有預(yù)設(shè)突變堿基的DNA片段, 擴(kuò)增的 DNA片段在預(yù)設(shè)突變處有重疊區(qū)域,混合重疊片段,并與兩個(gè)原始片段互補(bǔ)的側(cè)翼引物進(jìn)展第三次 PCR擴(kuò)增,以獲得全長(zhǎng) DNA;需兩個(gè)突變誘導(dǎo)引物,兩個(gè)側(cè)翼引物,3 次 PCR;誘變率極高大引物 PCR定點(diǎn)誘變:兩輪 PCR,2 個(gè)側(cè)翼引物,其中一個(gè)為預(yù)設(shè)突變引物,
37、第一輪 PCR后,大引物不需純化,第一輪退火溫度較低,其次輪較高效率可達(dá) 80第十三章 腫瘤相關(guān)基因72特點(diǎn):簡(jiǎn)潔,經(jīng)濟(jì),平均誘變癌基因 oncogene,onc. :是指細(xì)胞或病毒中存在的,能誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因,并參與 細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝;這些基因在正常情形下不表達(dá)或僅限量表達(dá),當(dāng)其被激活時(shí)那么可引起 癌變,通常將病毒中的這類癌基因稱為病毒癌基因 v-onc,細(xì)胞中存在的癌基因稱為細(xì)胞 由 于 c-onc 在 正 常 細(xì) 胞 中 以 非 激 活 狀 態(tài) 存 在 , 故 又 稱 為 原 癌 基 因 癌 基 因 c-onc, proto-onc. 原癌基因 :未激活的細(xì)胞癌基因在人體正常細(xì)胞中
38、存在是一種正常基因作用,可調(diào)控細(xì)胞生 長(zhǎng)和分化,廣泛存在于生物界中,從酵母到人的細(xì)胞中都存在;病毒癌基因v-onc 存在于病毒基因組的癌基因稱為病毒癌基因;它不編碼病毒的結(jié)構(gòu) 成分,對(duì)病毒的復(fù)制也沒(méi)有作用,但其反常表達(dá)可以使宿主細(xì)胞連續(xù)增殖 , 產(chǎn)生腫瘤或使培 養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞的動(dòng)物病毒基因;細(xì)胞癌基因 c-onc 存在于正常細(xì)胞基因組的癌基因稱為細(xì)胞癌基因c-onc ;在正常細(xì) 只有在肯定的條件下發(fā) 胞內(nèi)可以表達(dá), 其表達(dá)產(chǎn)物具有調(diào)劑細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化的功能;生轉(zhuǎn)變而有過(guò)度表達(dá)時(shí),才可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)pro-onc , 正常狀態(tài)下為非活化形式即原癌基因病毒癌基因和細(xì)胞癌基因的區(qū)分1.
39、轉(zhuǎn)錄調(diào)控:病毒癌基因轉(zhuǎn)錄效率高;細(xì)胞癌基因轉(zhuǎn)錄效率低; 2. 基因結(jié)構(gòu):病毒癌基因無(wú)內(nèi)含子;細(xì)胞癌基因有內(nèi)含子;3. 表達(dá)產(chǎn)物:病毒癌基因表達(dá)蛋白常缺失C 端,轉(zhuǎn)化功能加強(qiáng);4. 功能 : 病毒癌基因?qū)Σ《颈旧頍o(wú)關(guān)緊要,卻可使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化,引起腫瘤,而細(xì)胞癌基因?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能活動(dòng)卻是至關(guān)緊要的癌基因的激活機(jī)理1. 點(diǎn)突變 :原癌基因在射線或化學(xué)致癌劑作用下,可能發(fā)生單個(gè)堿基的替換導(dǎo)致點(diǎn)突變,從而轉(zhuǎn)變了表達(dá)蛋白的氨基酸組成,造成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)反常;點(diǎn)突變常見(jiàn)于 ras 癌基因ras 基因的表達(dá)產(chǎn)物 RAS是一種小分子 G蛋白,在信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用, ras 基因的點(diǎn)突變主要發(fā)生在第 1
40、2、13 和 61 位密碼子, 正常 RAS的作用因其自身的 GTP酶活性而受到嚴(yán)格掌握,而突變了的 RAS其 GTP酶活性下降或丟失, 失去了原有掌握, 致使增殖信號(hào)連續(xù)作用,細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化; ras 基因的點(diǎn)突變可導(dǎo)致多種腫瘤: H-ras 點(diǎn)突變導(dǎo)致膀胱癌、甲狀腺癌、宮頸癌、肺癌 K- ras 點(diǎn)突變導(dǎo)致結(jié)腸癌、肺腺癌、胰腺癌、膽管癌 N- ras 點(diǎn)突變導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、急性淋巴母細(xì)胞白血病等2. 啟動(dòng)子插入 :插入具有高活性的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子,使原癌基因長(zhǎng)久、過(guò)量地表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒的 LTR 含較強(qiáng)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子;雞淋巴細(xì)胞瘤由于白細(xì)胞增生病毒ALV的 LTR插入 c-my
41、c 的旁側(cè)5 或 3 端,使 c-myc 的表達(dá)比正常高 30-100倍3. 基因擴(kuò)增基因拷貝數(shù)的增加稱為基因擴(kuò)增;原癌基因擴(kuò)增使轉(zhuǎn)錄模板增加,mRNA的水DOC. 平增高, 表達(dá)活性增加, 產(chǎn)生過(guò)量的表達(dá)蛋白而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生;反常:雙微小染色體,無(wú)著絲粒,基因擴(kuò)增導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)4. 染色體易位 原癌基因在腫瘤細(xì)胞中從染色體正常位置轉(zhuǎn)移到其他某個(gè)位置上稱為染色體 易位;易位導(dǎo)致原先無(wú)活性的原癌基因移至啟動(dòng)子或增強(qiáng)子鄰近而激活;易位后失去原旁 側(cè)的抑制性調(diào)劑作用,使其表達(dá)增強(qiáng);不同的癌基因有不同的激活方式,一種癌基因也可有幾種激活方式;例如 c-myc 的激活就有基因擴(kuò)增和基因重排兩種方式,變,
42、各種癌基因之間存在協(xié)同作用 腫瘤發(fā)生的不同階段;抑癌基因 :一類抑制細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)、很少見(jiàn) c-myc 的突變; 而 ras 的激活方式那么主要是突 , 腫瘤的發(fā)生是多步驟,多因素的,不同的癌基因作用于增殖,從而遏制腫瘤形成,當(dāng)其缺失或變異抑癌功能喪失導(dǎo)致腫瘤生成的基因,也稱為腫瘤抑制基因或隱性癌基因;抑癌基因的主要功能:調(diào)劑細(xì)胞生長(zhǎng) 抑制細(xì)胞增殖 誘導(dǎo)終末分化和細(xì)胞凋亡 維護(hù)基因穩(wěn)固 抑制蛋白激酶活性轉(zhuǎn)變 DNA甲基化酶活性 調(diào)劑組織蛋白酶活性Rb基因 位于人 13 號(hào)染色體 q14, 全部序列約 200 kb, 含 27 個(gè)外顯子 , 可轉(zhuǎn)錄出 4.7kb 的 mRNA, 該 mRNA編碼分
43、子量為 105kD , 故被稱之為 P105 蛋白,能與 DNA結(jié)合; Rb 基因的作用是調(diào)劑細(xì)胞周期pRB具有兩種形式 : 磷酸化與非磷酸化非磷酸化的P105 為非活性型 , 可抑制細(xì)胞增殖, 磷酸化的 P105 為活性型可促進(jìn)細(xì)胞增殖Rb基因?qū)δ[瘤的抑制作用與轉(zhuǎn)錄因子 E-2F 有關(guān)E-2F 是一類激活轉(zhuǎn)錄作用的活性蛋白,掌握著 S 期的重要蛋白質(zhì)的合成如 DNA合成酶,在 G0、G1期,低磷酸化型的 Rb蛋白與 E-2F 結(jié)合成復(fù)合物,使 E-2F 處于非活化狀態(tài);在 S期, Rb 蛋白被磷酸化而與 E-2F 解離, E-2F 變成游離狀態(tài),細(xì)胞立刻進(jìn)入增殖階段;當(dāng) Rb基因發(fā)生缺失或突
44、變,丟失結(jié)合、抑制E-2F 的才能,于是細(xì)胞增殖活躍,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生;p53 基因定位 17p13.1 ,長(zhǎng) 20kb, 有 11 個(gè)外顯子, 10 個(gè)內(nèi)含子;外顯子1 不編碼; 2、4、5、7、8 分別編碼五個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域- :13-19 ,117-143 ,171-181 ,236-258 ,270-286 ; p53 基因轉(zhuǎn)錄生成 2.5kb mRNA,編碼生成 393 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì), 分子量為 53kD;1、P53 蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域:.N-端 17-80 肽段為酸性區(qū),具有轉(zhuǎn)錄因子活性,促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄;DNA. 102-292 肽段為 DNA結(jié)合區(qū),能與DNA特異序列
45、結(jié)合,結(jié)合時(shí)需要Zn 2+參與;. C- 端 300-393 肽段為 p53 四聚體結(jié)合部位,該部位除與p53 四聚體結(jié)合外,與非特異結(jié)合也有關(guān);P53 的生物學(xué)功能:1、抑制細(xì)胞增殖 P53 基因時(shí)刻監(jiān)控著基因的完整性,一旦細(xì)胞 DNA遭到損害, P53 蛋白與基因的 DNA 相應(yīng)部位結(jié)合,起特別轉(zhuǎn)錄因子作用,活化 p21 基因轉(zhuǎn)錄,P21 蛋白與cyclinE/CDK2 結(jié)合抑制該激酶的活性和其對(duì) PRb的磷酸化, 使細(xì)胞停滯于 G1期; P53 蛋白與復(fù)制因子 A 相互作用參與 DNA的損耗修復(fù);假如修復(fù)失敗,P53 蛋白即啟動(dòng)程序性死亡過(guò)程誘導(dǎo)細(xì)胞自殺,阻擋有癌變傾向突變細(xì)胞的產(chǎn)生,從
46、而防止細(xì)胞惡變;2、促進(jìn) DNA損耗修復(fù):當(dāng) DNA因各種物理、化學(xué)因素引起 DNA損耗時(shí), P53 蛋白與受損DNA部位結(jié)合,起特別轉(zhuǎn)錄因子的作用,活化 GADD45基因轉(zhuǎn)錄修復(fù) DNA; GADD45蛋白與 CDK3和增殖細(xì)胞核抗原 PA 結(jié)合形成復(fù)合體 CDK3/ GADD45蛋白 /PA,促進(jìn) DNA修復(fù); GADD45蛋白也可以 P21/CDK/ GADD45蛋白 /PA 四聚體形式,促使 DNA修復(fù)3、P53 蛋白仍可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡:當(dāng) DNA損耗不能修復(fù)時(shí),P53 可誘導(dǎo) Bax 基因表達(dá), 形成Bax / Bax 復(fù)合體,因 Bax 基因具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;另外
47、,當(dāng) DNA損耗時(shí),細(xì)胞表達(dá)DOC. p53 mRNA而導(dǎo)致 GADD45基因表達(dá)水平上升,使細(xì)胞的生長(zhǎng)停止或凋亡;第十四章基因診斷和基因治療, 從 DNA/RNA水平檢測(cè)分析致病基因的存在, 變異和表達(dá)狀態(tài)基因診斷 :應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)從而對(duì)疾病作出診斷的技術(shù)二、基因診斷的特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng):以探測(cè)疾病基由于目標(biāo),屬于“ 病因診斷;3106kb 的基因組中檢測(cè)出特異性高:以分子雜交技術(shù)為根本原理靈敏度高:基因探針帶有非常敏銳的檢測(cè)標(biāo)記,可從人類長(zhǎng)達(dá)某一基因的單堿基轉(zhuǎn)變;而且待測(cè)標(biāo)本微量;適應(yīng)性強(qiáng): 其應(yīng)用的 X 圍已從原先局限的遺傳性疾病擴(kuò)大到感染性疾病、腫瘤、 心血管疾病等領(lǐng)域;基因探針可為任何
48、來(lái)源,任何種類,探針序列可為亦可未知,檢測(cè)目標(biāo)可為內(nèi)源基因亦可外源基因,診斷 X 圍廣;早期診斷: 基因診斷不僅可對(duì)有表型顯現(xiàn)的疾病作出明確診斷,它仍可在產(chǎn)前早期診斷遺傳性疾病,可檢出感染疾病埋伏期的病原微生物、仍可猜測(cè)和早期發(fā)覺(jué)某些惡性腫瘤;基因診斷的根本流程:制備基因探針;提取目的基因,獲得單鏈DNA; PCR 擴(kuò)增 DNA;目的 DNA與尼龍膜結(jié)合;探針與目的DNA互補(bǔ)配對(duì);沖洗尼龍膜;檢測(cè)雜合分子基因診斷的根本技術(shù)一、核酸分子雜交hybridization依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原那么,將樣品 DNA/RNA雙鏈經(jīng)變性處理,參與已標(biāo)記的單鏈 DNA/RNA探針,樣品中與探針互補(bǔ)的 DNA/RN
49、A序列可與探針形成雜交雙鏈 DNA,通過(guò)顯示標(biāo)記物或其它方法來(lái)檢測(cè)特定的核酸片段;分子雜交技術(shù)過(guò)程:探針制備與標(biāo)記同位素或非同位素待測(cè)核酸樣品制備別離,純化雜交液相,固相雜交后處理去掉非特異雜交分子顯示結(jié)果顯色,發(fā)光,放射自顯影結(jié)果分析分子雜交的根本方法原位雜交 不須提取 DNA或 RNA;直接用培育 / 采集的細(xì)胞涂載玻片上、組織切片固定載玻片上 和細(xì)菌菌落復(fù)印至濾膜上與標(biāo)記核酸探針雜交;可測(cè)知特定基因的存在或表達(dá)狀況;仍可觀看被測(cè)基因在細(xì)胞內(nèi)或染色體上的定位;斑點(diǎn)印跡雜交 把提取的 DNA/RNA樣本,直接點(diǎn)到硝酸纖維膜或尼龍膜上與標(biāo)記核酸探針雜交;通過(guò)纖維素膜雜交斑點(diǎn)的放射自顯影或膠片斑
50、點(diǎn)的光吸取值掃描可以測(cè)定待檢核酸的含量;可檢測(cè)特定基因的存在或表達(dá)情形;Southern 印跡雜交 將制備的 DNA經(jīng)酶切電泳、 再轉(zhuǎn)印到固相支持物上,用探針雜交后進(jìn)展檢測(cè)的方法,用于 DNA/DNA雜交;該方法主要用于檢測(cè)基因組中待測(cè)的基因或序列Northern 印跡雜交 檢測(cè) RNA主要是 mRNA的方法PCR根本原理 DNA復(fù)制.三個(gè)步驟:變性denaturation 退火 annealing延長(zhǎng) extension 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析RFLP限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別特定的DNA序列,并在其中的某一特定堿基位點(diǎn)限制性位點(diǎn)將 DNA切斷,使 DNA形成限制性片段 . RFLP技術(shù)診斷
51、疾病的機(jī)理 : 由于基因突變的結(jié)果 , 使 DNA上原有的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列發(fā)生轉(zhuǎn)變 , 導(dǎo)致使用限制酶去切割時(shí)得到的結(jié)果與不發(fā)生突變的結(jié)果完全不同 , 可借此做出診斷. 如: 某些遺傳性疾病發(fā)生特異的點(diǎn)突變 , 而點(diǎn)突變位置正好是某些酶的識(shí)別和切割點(diǎn) , 可用酶切方法做出診斷 . DOC. 1. 點(diǎn)多態(tài)性 表現(xiàn)為 DNA鏈中發(fā)生單堿基突變,且突變導(dǎo)致一個(gè)原有酶切位點(diǎn)的丟失或形成一個(gè)新的酶切位點(diǎn);據(jù)此,樣品 DNA經(jīng)特定內(nèi)切酶消化或 Southern 印跡雜交即可診斷某些疾??;2. 序列多態(tài)性 DNA鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)、插入等變異;結(jié)果,內(nèi)切酶位點(diǎn)本身堿基序列雖未轉(zhuǎn)變,但原有內(nèi)切酶
52、位點(diǎn)在基因組中的相對(duì)位置轉(zhuǎn)變了從而導(dǎo)致 RFLP;也可用 Southern 印跡雜交診斷相關(guān)疾??;基因芯片 Gene chip, DNA chip,又稱為 DNA微陣列 DNA Microarray,是指固定在載體上的高密度 DNA微點(diǎn)陣;詳細(xì)地說(shuō)就是將DNA片段或 cDNA片段作為探針,嚴(yán)密有序地排列固定于支持物 多聚賴氨酸硅膠上,然后與熒光標(biāo)記的樣品分子進(jìn)展雜交,通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿与s交信號(hào)的強(qiáng)度,獵取樣品分子的數(shù)量和序列信息;限制性內(nèi)切酶譜分析法 RE 等位基因特異寡核苷酸探針 ASO 原理 :針對(duì)突變位點(diǎn)的基因:可以分別針對(duì)突變位點(diǎn)的序列,設(shè)計(jì)一對(duì)寡核苷酸探針,其中一條為野生型探針,與
53、無(wú)突變序列互補(bǔ),另一個(gè)為突變型探針,與突變序列互補(bǔ);同時(shí)設(shè)計(jì)探針時(shí), 突變堿基應(yīng)位于探針的中心,這樣在嚴(yán)格掌握雜交和洗脫條件下,只有完全互補(bǔ)的探針儲(chǔ)存下來(lái),形成穩(wěn)固雜交分子,而中心堿基與靶序列不匹配的探針那么被洗脫;一、遺傳性疾病的診斷例 1:鐮狀紅細(xì)胞貧血 HBS-Beta 株蛋白基因突變點(diǎn)突變 , 發(fā)生在限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法 RFLP PCR- 限制性內(nèi)切酶分析技術(shù) Southern blot 鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥是由于 b 珠蛋白基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致 mRNA第 6 位密碼子 GAG突變成 GUG,導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)反常 Glu Val ,限制酶 Mst 1 識(shí)別序列,突變后
54、不能識(shí)別,酶切位點(diǎn)消逝,限制酶切片段長(zhǎng)度發(fā)生變化;Southern blot 檢測(cè)鐮狀細(xì)胞貧血,制備血液 DNA MstII消化 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 與標(biāo)記的珠蛋白 DNA雜交 放射自顯影; PCR擴(kuò)增檢測(cè) PCR擴(kuò)增珠蛋白基因 MstII 消化 瓊脂糖電泳 EB染色例 2: 地中海性貧血基因診斷PCR-ASO點(diǎn)突變,無(wú)限制性酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)變,采納PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針雜交技術(shù)突變 Gene 部位和性質(zhì),合成寡核 雜交 / 斑點(diǎn)雜交;Normal Gene 苷酸探針,32P 標(biāo)記,進(jìn)展Probe與正常 雜交穩(wěn)固Southern Blot Mutation S Gene P
55、robe 與反常S雜交穩(wěn)固病原體基因診斷的主要技術(shù)方法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR Real Time Flourescence quantitative PCR, FQ PCR 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 在常規(guī) PCR 根底上,添加了一條標(biāo)記 2 個(gè)熒光基團(tuán)的熒光雙標(biāo)記探針;一個(gè)標(biāo)記在探針的 5 端,稱為熒光報(bào)告基團(tuán) R ;另一個(gè)標(biāo)記在探針的 3 端,稱為熒光抑制基團(tuán)淬滅基團(tuán) Q ;探針的 3 羥基 -OH 已被去除或封閉,不具有延長(zhǎng)才能; 在探針?lè)肿油暾那樾蜗? R 發(fā)出的熒光被 Q 淬滅吸??; 此時(shí)檢測(cè)不到熒光信號(hào);當(dāng)特異性 PCR 擴(kuò)增發(fā)生時(shí),探針會(huì)在 PCR 過(guò)程中被 Taq 酶的 5 -3
56、外切酶 活性作用切斷,釋放出 R 基團(tuán) , Q 的抑制作用消逝,從而引起報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)的產(chǎn)生 , 熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條 DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCR產(chǎn)物形成完全同步;熒光信號(hào)相伴 PCR 產(chǎn)物的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)目前用于臨床檢測(cè)的病原體基因診斷試劑絕大局部是此類;指紋圖譜法 : 用 HinfI 切割染色體 DNA.由于該酶在小衛(wèi)星 DNA的重復(fù)序列上無(wú)切點(diǎn) , 因此電泳后在用標(biāo)記的小衛(wèi)星 DNA做探針雜交時(shí) , 不同個(gè)體顯現(xiàn)不同的雜交帶型 , 稱為指紋圖譜 . 至今世界上仍未發(fā)覺(jué)有兩個(gè)人的雜交帶型完全一樣 .1 高度的特異性 2 穩(wěn)固的遺傳性:
57、DNA 是人的遺傳物質(zhì),其特點(diǎn)是由父母遺傳的;分析發(fā)覺(jué), DNA .指紋圖譜中幾乎每一條帶紋都能在其雙親之一的圖譜中找到,這種帶紋符合經(jīng)典的孟德?tīng)栠z傳規(guī)律,即雙方的特點(diǎn)平DOC. 均傳遞 50 給子代; 3 體細(xì)胞穩(wěn)固性:即同一個(gè)人的不同組織如血液、 . 肌肉、毛發(fā)、精液等產(chǎn)生的 DNA 指紋圖形完全一樣;基因治療 :指應(yīng)用 DNA重組技術(shù), 將外源正?;?qū)氚屑?xì)胞,反常引起的疾病 , 以達(dá)到治療的目的;以訂正或補(bǔ)償因基因缺陷和基因敲除技術(shù) gene knockout 是指通過(guò)基因同源重組的過(guò)程定向的在活細(xì)胞中從基因組上 移出特定基因的過(guò)程,從而建立基因剔除細(xì)胞和基因剔除生物;直接基因治療和
58、間接基因治療1、直接基因治療 致病基因的原位置換 :訂正突變基因,在原位修復(fù)缺陷的基因,以達(dá)到治療目的,為較抱負(fù)的基因治療策略;2、 間接基因治療:1 基因增補(bǔ):將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞,并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),不需將缺陷基因替換出來(lái),只 要目的基因在細(xì)胞中能夠表達(dá),就達(dá)到了治療的目的;這是目前基因治療大多采納的方法,對(duì)單拷貝基因遺傳病有效;如血友?。? 基因干預(yù) gene interference :指采納特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá),或者通過(guò)破壞某個(gè)基因而使之不表達(dá),以達(dá)到治療疾病的目的;基因干預(yù)的種類:反義RNA:封閉基因表達(dá);核酶:裂解特異的靶mRNA;RNA干預(yù)技術(shù):反義 RNAantisen
59、se RNA:是指與 mRNA互補(bǔ)的 RNA分子 , 通常由 15-20 個(gè)核苷酸組成 ;這種反義 RNA能與 mRNA分子特異性地互補(bǔ)結(jié)合形成二聚體 , 從而阻擋靶核酸的表達(dá);1. 反義寡聚核苷酸可以激活 RNaseH,該酶可以切割 DNA RNA雜合分子中的 RNA鏈,導(dǎo)致靶 mRNA降解 2. 反義寡聚核苷酸可以通過(guò)空間位阻效應(yīng)阻擋核糖體結(jié)合來(lái)抑制靶 mRNA的翻譯RNA干預(yù) RNA interference, RNAi 是一種由雙鏈 RNA誘發(fā)的基因緘默現(xiàn)象;在此過(guò)程中,與雙鏈 RNA有同源序列的信使 RNAmRNA被降解,從而抑制該基因的表達(dá);RNA干預(yù)機(jī)制 : 外源 dsRNA進(jìn)入
60、細(xì)胞后可激活 Dicer 多種核酸 酶、解螺旋酶、RNA依靠的 RNA聚合酶, 可以切割雙鏈 RNA,雙鏈 RNA再與 Dicer 形成緘默復(fù)合物 RISC ,RISC具有結(jié)合和切割 mRNA的作用而介導(dǎo) RNA干預(yù)的過(guò)程;2 個(gè)步驟:1長(zhǎng)雙鏈 RNA被細(xì)胞源性的雙鏈 RNA特異的核酸酶 Dicer 切成 21-23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈 RNA,稱為小干擾性 RNAsmall interfering RNA 2小干擾性 RNA 與細(xì)胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體,稱為RNA 誘導(dǎo)的緘默復(fù)合體RNA-induced silencing plex,RISC,該復(fù)合體可識(shí)別與小干擾性RNA有同源序列的
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