微生物遺傳與分子生物學(xué)第2講-研究員

1、第 2 講：放線菌的生物學(xué)特性及其遺傳基礎(chǔ)第一章放線菌概述放線菌是一類絲狀革蘭氏陽性細(xì)菌，因在固體培養(yǎng)基上菌絲呈輻射狀而得名。放線菌菌絲發(fā)達(dá)，通常可分為基質(zhì)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲末端會產(chǎn)生不同形狀的孢子。放線菌廣泛分布于自然界的土壤、河流、海洋以及動植物等特殊生存環(huán)境中，多為腐生，少數(shù)種類為寄生。放線菌主要以產(chǎn)生孢子進(jìn)行繁殖，個別種會通過斷裂生殖。放線菌組通常具有較高的（G+C）mol%含量。放線菌由于能夠產(chǎn)生種類豐富的次級代謝產(chǎn)物、酶制劑等而備受人們關(guān)注。放線菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物除為人們所熟知的鏈霉素、卡那霉素、氯霉素、素、井岡霉素、霉素等重要醫(yī)用和農(nóng)用抗生素外，還包括免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗

2、劑等。放線菌中有效描述種約 2000 余個，歸為 140 個屬。其中屬霉菌屬（Streptom）的有 700 余個種。因此鏈霉菌屬是放線菌中的最大類群，也被稱為常見放線菌。除鏈霉菌屬外，常見的放線菌還包括諾卡氏菌屬（Nocardia）、放線菌屬（ Actinomy）、小單孢菌屬（ Micromonospora ）、鏈孢囊菌屬（Streptosporangium）、游動放線菌屬（Actinoplanes）等。1.鏈霉菌概述鏈霉菌最早是由 Ferdinand Cohn 分離獲得，并詳細(xì)描述其特征。SelmanWaksman 于 1942 年首次將它命名為鏈霉菌（Streptom）。1.1 鏈霉菌的

3、特點鏈霉菌具有相對簡單的遺傳背景。多數(shù)鏈霉菌具有線性組，大小在6-10Mb，含有 8000 個左右的開放閱讀框（ORFs）。隨著組技術(shù)的迅猛發(fā)展，目前已經(jīng)有超過 300 株鏈霉菌完成了組全序列測定或框架圖。以模式菌株-天藍(lán)色鏈霉菌為例（表 2.1），其組大小為 8,667,507-bp，GC%為 72.1%，其密度約為 991-bpCDS （coding sequence），推測含有 7,825 個，為1大腸桿菌、枯草桿菌等細(xì)菌的 1.7 倍，甚至比擁有 6000 個的真核生物釀酒酵母的數(shù)還多。在 7,825 個開放閱讀框中，包括 29 個推測與次級代謝產(chǎn)物（如抗生素、色素、復(fù)合脂、信號分子和

4、鐵載體等）生物相關(guān)的簇；該組包含 12.3%的調(diào)控，主要參與應(yīng)激外界刺激和脅迫反應(yīng)以及調(diào)控菌落發(fā)育的不同階段，這種情況在細(xì)菌中是比較特殊的，這和鏈霉菌要適應(yīng)土壤這一復(fù)雜生存環(huán)境是分不開的。此外，天藍(lán)色鏈霉菌含有兩個大質(zhì)粒：線性的 SCP1（365 kb）和環(huán)狀 SCP2（31 kb）也分別完成。表 2.1 天藍(lán)色鏈霉菌組的特征Component of chromosomepropertyTotal size8,667,507 bpTerminal inverted repeat21,653 bpG+C content72.12%Coding sequen7,825of which pseudo

5、genesCoding density5588.9%Average gene length991 bpRiomal RNAs6x(16S-23S-5S)Transfer RNAs63Other stable RNAs3鏈霉菌具有相對復(fù)雜的發(fā)育分化生命周期（圖 2.1）。鏈霉菌能形成分支的氣生菌絲，并能在特化的氣生菌絲頂端產(chǎn)生孢子進(jìn)行繁殖，這些特性有可能是它們在長期進(jìn)化過程中為適應(yīng)相似的生態(tài)環(huán)境而獲得的(Flardh et al., 2000)。在固體培養(yǎng)基上，鏈霉菌能夠從一個簡單的孢子萌發(fā)，通過頂端生長形成多細(xì)胞的基質(zhì)菌絲；當(dāng)基質(zhì)菌絲受培養(yǎng)基中營養(yǎng)匱乏等脅迫或感受其他信號時，會進(jìn)一步小分子信號

6、物質(zhì)，加速分化并形成氣生菌絲；氣生菌絲進(jìn)一步螺旋分隔形成單組的前孢子單元（prespore compartments）；然后孢子壁加厚并最終產(chǎn)生堅硬、耐干旱的成熟孢子。鏈霉菌的孢子在干旱條件下能存活很長時間，但它對惡劣環(huán)境的抗逆性與芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢相比相差很多，所以它們最主要的作用可能是在2自然界中盡可能大范圍的，來增大成活的概率。鏈霉菌的每個發(fā)育分化階段都具有明顯的形態(tài)特征，并且與發(fā)育分化相關(guān)的破壞都可能會引起相應(yīng)表型的變化，這就為的功能提供了一個直觀的反映，可以作為研究的切入點，所以鏈霉菌一直以來都是研究原核生物發(fā)育分化良好的模式材料。圖 2.1 天藍(lán)色鏈霉菌形態(tài)分化鏈霉菌具有產(chǎn)生種類繁

7、多的次級代謝產(chǎn)物的強大能力。伴隨著鏈霉菌由基質(zhì)菌絲生長進(jìn)入氣生菌絲生長階段，周圍的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，菌體感受到營養(yǎng)匱乏的信號，開始啟動細(xì)胞程序性過程，降解自身的基質(zhì)菌絲，并其中的營養(yǎng)物質(zhì)用于氣生菌絲的生長和產(chǎn)孢。抗生素在此時大量產(chǎn)生，并擴(kuò)散到基質(zhì)菌絲周圍，對鄰近的微生物起到抑制或者殺死作用，來保證自己在生存競爭中處于優(yōu)勢(圖 2. 2)。3圖 2.2 在自然環(huán)境中鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物伴隨形態(tài)分化而產(chǎn)生鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物種類豐富，其中有多種抗生素具有重要的醫(yī)用價們譽為天然藥物的工廠。1944 年，瓦克斯曼（Selman Abraham值，Waksman, 1888-1973 ）在灰色鏈霉菌

8、中發(fā)現(xiàn)了能有效治療肺結(jié)核的鏈霉素（Streptomycin），開創(chuàng)了鏈霉菌研究的新中分離到的氯霉素、紅霉素、納他霉素、。隨后幾年又相繼從鏈霉菌培養(yǎng)液、萬古霉素等多種抗生素，這些抗生素在人類與疾病的歷史中發(fā)揮了的作用。據(jù)統(tǒng)計，在目前所報道的次級代謝產(chǎn)物中，60%以上是由鏈霉菌產(chǎn)生的。隨著新技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用，從鏈霉菌中分離到了有應(yīng)用價值的次級代謝產(chǎn)物，如抗腫瘤、抗真菌、抗寄生蟲、抗血栓及抗衰老等生物活性物質(zhì)。近年來，隨著鏈霉菌序列的不斷公布、鏈霉菌遺傳學(xué)和組合生物學(xué)的發(fā)展、抗生素生物途徑中表達(dá)和調(diào)控機制的詳細(xì)研究，使得大量組合而成的新型抗生素和隱性抗生素得以發(fā)現(xiàn)。天藍(lán)色鏈霉菌組中具有 29 個次級

9、代謝產(chǎn)物簇，目前已獲得了 17 種次級代謝產(chǎn)物（圖 2.3）。然而，其中大部分在人工培養(yǎng)條件下不表達(dá)或表達(dá)量很低，被稱為“隱性簇”或“靜默簇”。4圖 2.3 天藍(lán)色鏈霉菌產(chǎn)生的主要次級代謝產(chǎn)物1.2 幾種重要的鏈霉菌根據(jù)鏈霉菌在人類生產(chǎn)生活中所扮演的角色，可以將鏈霉菌分為模式菌株、工業(yè)菌株、病原菌和特殊生境鏈霉菌。1.2.1 模式菌株-天藍(lán)色鏈霉菌天藍(lán)色鏈霉菌是鏈霉菌遺傳學(xué)研究的模式菌株，能產(chǎn)生放線紫紅素(Act)、十一烷基靈菌紅素(Red)、次甲基霉素（Mmy）和鈣依賴抗生素(CDA)四種化學(xué)結(jié)構(gòu)截然不同的抗生素。英國 John Innes的 Hopwood 和 Chater 等人以天藍(lán)色鏈

10、霉菌為模式材料，用遺傳學(xué)方法獲得了一系列形態(tài)分化阻斷突變株，包括白色突變株和光禿型突變株；并在此基礎(chǔ)上得到了與形態(tài)分化相關(guān)的。與鏈霉菌形態(tài)分化有關(guān)的主要有兩類，即光禿（bld）和白（whi）。對這些的結(jié)構(gòu)和功能研究為揭示鏈霉菌形態(tài)分化的分子機制奠定了基礎(chǔ)。天藍(lán)色鏈霉菌具有相對清晰的形態(tài)分化階段，如基質(zhì)菌絲、氣生菌絲以及孢子鏈等。天藍(lán)色鏈霉菌還能夠產(chǎn)生肉眼可見的在堿性條件下呈現(xiàn)藍(lán)色的次級代謝產(chǎn)物（放線紫紅素），為研究鏈霉菌中次級代謝的產(chǎn)生及其調(diào)控提供了便利的條件。因此，天藍(lán)色鏈霉菌也成為研究鏈霉菌形態(tài)分化和次級代謝的模式生物。5圖 2.4 天藍(lán)色鏈霉菌在自然環(huán)境中及人工培養(yǎng)條件下的形態(tài)1.2.2

11、 工業(yè)菌株-霉菌霉菌、灰色鏈霉菌等因為能夠產(chǎn)生對人類生產(chǎn)生活極為重要的農(nóng)用和易用抗生素，而被用于工業(yè)生產(chǎn)。由于具有重要的應(yīng)用價值以及用于工業(yè)生產(chǎn)，這些菌株也被稱為工業(yè)菌株。霉菌是一種重要的工業(yè)微生物，產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿維菌素。霉菌組大小為 9,025,608bp，GC 含量為組的 6.6%）參70.7%，編碼 7,574 個開放閱讀框，推測其中 37 個簇（與次級代謝產(chǎn)物的生物。這37 個簇中有12 個參與聚酮類抗生素的，對這些簇及其編碼的酶的研究，將為次級代謝產(chǎn)物的生物機制的闡明提供有利的依據(jù)。6圖 2.5霉菌形態(tài)及其組1.2.3 病原菌-瘡痂鏈霉菌除有益的方面，部分鏈霉菌對人類的生產(chǎn)和

12、生活也會造成，如馬鈴薯瘡痂鏈霉菌引起的馬鈴薯瘡痂病等，這部分鏈霉菌被稱為病原菌。瘡痂鏈霉菌是一個很重要的馬鈴薯瘡痂病植物病源細(xì)菌，組序列測定亦已完成，大小為10,148,695 bp，GC 含量為 71.45%（）。1.2.4 特殊生境放線菌鏈霉菌主要分布于土壤環(huán)境中。然而近年來的研究表明，在海洋、極地、以及動植物體內(nèi)都有鏈霉菌的存在，這些鏈霉菌被稱為特殊生境鏈霉菌。特殊生境鏈霉菌也成為近年來新型活性次級代謝產(chǎn)物的重要來源之一。第二章鏈霉菌形態(tài)分化和次級代謝的遺傳基礎(chǔ)鏈霉菌屬于放線菌綱、放線菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌屬。鏈霉菌是土壤中最豐富的一類絲狀細(xì)菌，在降解來自動植物的不可溶的有機物以及碳循環(huán)

13、中起著重要作用，具有類似于絲狀真菌的復(fù)雜的形態(tài)分化，能夠產(chǎn)生大量的種類和功能各7異的次級代謝產(chǎn)物。1.鏈霉菌組特征由霉菌是重要的模式菌株，并且具有重要的工業(yè)、應(yīng)用價值，人們很希望上述鏈霉菌復(fù)雜的表型、生理生化特征以及抗生素的調(diào)控機制能夠從水平得到解釋，并且能夠遺傳操作以便更大范圍的開發(fā)利用。隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，多個鏈霉菌已完成了全組，其中天藍(lán)色鏈霉菌、霉菌和灰色鏈霉菌的全組已詳細(xì)注釋并公開。三個組的共性反映出了鏈霉菌組的三個顯著的特征：第一，組與一般細(xì)菌相比都很大。天藍(lán)色鏈霉菌組長約 8.66 Mbp，編碼 7825 個蛋白霉菌組長 9.02 Mbp，編碼 7581 個蛋白，灰色鏈霉菌組長約

14、8.55 Mbp，編碼 7138 個蛋白，明顯高于其他一些微生物，例如，E. coli（H10407）的組約為 5.2 Mbp，枯草芽孢桿菌（gtP20b）的組約為 4.2 Mbp；第二，它們的組都呈線狀結(jié)構(gòu)，包括：中間的保守區(qū)（約 6.4 Mb）主要是與生長發(fā)育相關(guān)的必須；兩側(cè)的可變區(qū)（約 1-2 Mb），主要含有非必需，大量次級代謝產(chǎn)物簇和壓力應(yīng)答相關(guān)都位于此區(qū)域，這可能與進(jìn)化過程中獲得新的功能有關(guān)。第三，末端都具有末端反向重復(fù)序列且共價結(jié)合有末端蛋白，盡管在其它細(xì)菌中也有線狀的（如螺旋體和農(nóng)桿菌），目前的信息表明在原核生物中只有鏈霉菌和其它一些放線菌具有這樣一種類似“端粒”的結(jié)構(gòu)。另外在

15、鏈霉菌基因組中調(diào)控所占的很大，天藍(lán)色鏈霉菌中有 900 多個調(diào)控蛋白，約占總數(shù)的 12.3%，編碼 sigma 因子的有 65 個，它們能和 RNA 聚合酶結(jié)合，指導(dǎo)在不同的時空條件下轉(zhuǎn)錄，參與鏈霉菌對外刺激和壓力的反應(yīng)過程，這與鏈霉菌天然生長環(huán)境的復(fù)雜多變是相適應(yīng)的。8圖 2.6 天藍(lán)色鏈霉菌組天藍(lán)色鏈霉菌與結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、白喉棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheriae）組的比較發(fā)現(xiàn)，其區(qū)域保守，說明進(jìn)化上它們的區(qū)域來自同一放線菌祖先，而兩臂在進(jìn)化中通過平行轉(zhuǎn)移獲得。天藍(lán)色鏈霉菌與霉菌組相比，6.5 Mb 區(qū)域高度保

16、守，而末端區(qū)域保守性低，而正是這些保守性低的區(qū)域賦予兩者不同的特性。天藍(lán)色鏈霉菌有 65 個因子編碼，其中大約 45 個屬于胞外功能類（extracytoplasmicfunction, ECF），這類因子參與應(yīng)激各種環(huán)境刺激的轉(zhuǎn)錄。霉菌中ECF 類因子的數(shù)量與天藍(lán)色鏈霉菌相當(dāng)。這暗示鏈霉菌生命周期中控機制是錯綜復(fù)雜的。表達(dá)調(diào)表 2.2 天藍(lán)色鏈霉菌、霉菌和灰色鏈霉菌組特征9天藍(lán)色鏈霉菌 A3(2)霉菌MA24680灰色鏈霉菌IFO13350長度8,667,507 bp9,025,608 bp8,545,929bpG+C 含量72.1%70.7%72.2%末端重復(fù)序列（TIR）21,65349

17、132,910越來越多的鏈霉菌組全序列測定，方便了將比較組、代謝組和蛋白質(zhì)組的研究和策略引入鏈霉菌研究，這些研究必將使更加深入的了解鏈霉菌的遺傳特征，有助于人們對鏈霉菌資源更有效、更理性的利用。2. 鏈霉菌線性與遺傳不穩(wěn)定性鏈霉菌普遍具有遺傳不穩(wěn)定性。如果將鏈霉菌孢子收集起來后，再稀釋圖譜平板，在正常培養(yǎng)條件下就會發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)很多表型上與野生型菌株不同的變異菌落。如分支鏈霉菌(S. ramosus)在菌種選育過程中顯著的遺傳不穩(wěn)定性，導(dǎo)致產(chǎn)孢缺陷、光禿表型等多種特征（圖 2.7）。1993 年人們首次發(fā)現(xiàn)變鉛青鏈霉菌中是線性的末端具有反向重復(fù)序列，5末端具有共價結(jié)合蛋白。進(jìn)而，人們發(fā)現(xiàn)鏈霉菌的遺傳

18、不穩(wěn)定性與其線性的有關(guān)。天藍(lán)色鏈霉菌M145M145是一株來源于野生株 A3(2)的質(zhì)粒缺失菌株。組序列表明, A3(2) 比的發(fā)現(xiàn)為研究鏈霉菌的具有更長的末端序列（TIRs）。線性遺傳不穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)。10蛋白編碼7,825 個7,581 個7,138 個平均大小991 bp1,034 bp1,055 bp編碼占組的比例88.9%86.2%88.1%rRNA(16S-23S-5S)6 個6 個6 個tRNA63 個68 個66 個次級代謝簇29 個37 個36 個圖 2.7 鏈霉菌遺傳不穩(wěn)定導(dǎo)致的表型變化末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，主要由特定的 DNA 序列與蛋端粒是真核生物白質(zhì)，其主要生物學(xué)功能

19、是保證末端完整，使結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。鏈霉菌雖然屬于原核生物，但也具有端粒（圖 2.8）。鏈霉菌端粒末端的二級結(jié)構(gòu)對霉菌線性或質(zhì)粒的是必須的。末端的 91 nt 具有 4 個回文IV 具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)?；匚慕Y(jié)構(gòu) II 和 III 具結(jié)構(gòu)（倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列），其中從 II 到有末端蛋白 Tap 結(jié)合序列?；匚男蛄蠭 具有由 Tpg primer的 13-nt 的延伸引物序列。如果末端結(jié)合序列缺失，會導(dǎo)致形成環(huán)狀。圖 2.8 鏈霉菌端粒的典型特征3.鏈霉菌DNA 大片段缺失及其產(chǎn)生機制11叉停滯模型（圖 2.9）。叉在進(jìn)行過程中遇到單鏈斷裂而停滯，并導(dǎo)致 DNA 雙鏈斷裂。具有雙鏈斷裂的 DNA 可以通過同源重

20、組修復(fù)而獲得完整的末端序列。如果該 DNA 斷裂與分子內(nèi)的另一個臂發(fā)生非同源重組，則會導(dǎo)致環(huán)化，而失去末端序列。如果該 DNA 斷裂與另一條進(jìn)行分子間非同源重組，則會導(dǎo)致 DN段缺失或者增加某些區(qū)域的拷貝。圖 2.9叉停滯模型4.鏈霉菌DNA 擴(kuò)增及其產(chǎn)生機制4.1特定部位的高頻擴(kuò)增12大片段的缺失常伴隨有 DNA 的擴(kuò)增，有的擴(kuò)增序列（lified DNAsequence, ADS）包含有幾十到幾百個拷貝的擴(kuò)增（lified units of DNA,AUD）,它們串聯(lián)排列，有時總長可占部位的高頻擴(kuò)增。的一半。這種現(xiàn)象稱為特定4.2 高頻擴(kuò)增的產(chǎn)生機制擴(kuò)增（AUD）可能是一些能夠捕獲叉的序列

21、。叉遇到AUD 時速度減慢，在叉的上下游序列間發(fā)生同源重組或非同源重組，這時就形成一個擴(kuò)增前體，隨后進(jìn)行滾環(huán)，形成大量串聯(lián)排列的重復(fù)序列。如圖，叉經(jīng)過 RsD 時停頓，叉前面的 RsA 與叉后面的 RsB 發(fā)生重組，產(chǎn)生一個包含 RsD 的滾環(huán)，隨后開始滾環(huán)，直到 RsC 與 RsD 之間發(fā)生重組，上則出現(xiàn)大量串聯(lián)排列的重復(fù)序使得滾環(huán)結(jié)構(gòu)，恢復(fù)正常，而在列（圖 2.10）。13圖 2.10 高頻擴(kuò)增的產(chǎn)生機制4.3 鏈霉菌鏈霉菌臂的移位臂的移位，是指整個末端區(qū)域或者亞末端區(qū)域片段轉(zhuǎn)移到其他或者自身的另一個末端上。如圖 2.11，當(dāng)叉停頓后引起DNA 雙鏈斷裂后，如果發(fā)生分子間的重組修復(fù)，則會獲

22、得完整的末端（A），如果發(fā)生分子內(nèi)重組修復(fù)，則會發(fā)生臂的移位（B）。圖 2.11 鏈霉菌臂的移位5.鏈霉菌的翻譯調(diào)控在鏈霉菌中，bldA 編碼識辨亮氨酸稀有子 UUA 的 tRNA。該并非細(xì)（圖 2.12）。在鏈霉在生長穩(wěn)定期的大量表達(dá)菌生長所必須，但對鏈霉菌的生理分化和形態(tài)分化菌組中有 2-3%的含有 TTA子，這些與 bldA 直接相關(guān)。14圖 2.12 天藍(lán)色鏈霉菌中由 bldA 的功能6.鏈霉菌組的其他特征天藍(lán)色鏈霉菌組含有 12.3%的調(diào)控。組含有800 個編碼外泌蛋白的編碼，其中 147 個酶編碼基天藍(lán)色鏈霉菌位編碼水解酶的包括 7 個素酶編碼和 5 個因）。20%的外泌蛋白通過（

23、twin arginine translocation）系統(tǒng)轉(zhuǎn)運。含有 614 個轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白編碼。含有50 個 ECF（extracytoplasmic function）s 因子編碼含有 67 個雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。的次級代謝產(chǎn)物生物簇。P450 細(xì)胞色素氧化酶（CYPs）編碼。7.外遺傳物質(zhì)大多數(shù)鏈霉菌都含有質(zhì)粒，幾乎都是可自我轉(zhuǎn)移的遺傳致育因子，有線性和環(huán)型兩種（圖 2.13）。線性質(zhì)粒約 10-600 kb，末端具有反向重復(fù)序列。按照結(jié)構(gòu)可以分為：線型質(zhì)粒（如 SCP1、SAP1）和環(huán)型質(zhì)粒（如 SCP2）；按照在細(xì)胞內(nèi)15的擴(kuò)增方式可以分為：整合型質(zhì)粒（如 pSET152）和pKC

24、1139）。型質(zhì)粒（如 pIJ702、鏈霉菌的遺傳物質(zhì)主要是通過轉(zhuǎn)移質(zhì)粒介導(dǎo)的接合作用進(jìn)行轉(zhuǎn)移。大多數(shù)鏈霉菌的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒都具有致死接合反應(yīng)的特征，在表型上顯示麻點狀態(tài)（麻點，是指將含有轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的菌株接種到不含有該質(zhì)粒的菌株上培養(yǎng)時，產(chǎn)生的環(huán)狀暈圈現(xiàn)象）。鏈霉菌所有的接合質(zhì)粒都能夠產(chǎn)生致死接合反應(yīng)。在鏈霉菌分子生物學(xué)的研究早期，通過是否產(chǎn)生麻點，就可以較容易判定鏈霉菌中是否存在接合質(zhì)粒，并通過致死接合反應(yīng)在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了一系列接合質(zhì)粒，如SCP2-。目前，改造后的 SCP2*已作為克隆載體和鏈霉菌-大腸桿菌之間的穿梭載體被廣泛應(yīng)用。圖 2.13 天藍(lán)色鏈霉菌中的外遺傳物質(zhì)第三章鏈霉菌分子生物學(xué)研究

25、的主要技術(shù)方法1鏈霉菌中常用的是一種編碼容易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的。把它的編碼序列和目的啟動子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列融合形成嵌合，可以用來目的的表16達(dá)調(diào)控?，F(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于啟動子分析、表達(dá)監(jiān)測、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及藥物篩選等研究領(lǐng)域。目前鏈霉菌中常用的包括兒茶酚雙加氧酶基因（xylE），熒光素酶編碼（luxAB），綠色熒光蛋白編碼（GFP）以及一些抗性等（圖 2.14）。圖 2.14 利用 EGFP 作為鏈霉菌中的兒茶酚雙加氧酶（由 xylE 編碼，來自 Pseudomonas茶酚產(chǎn)生黃色物質(zhì)，xylE 成為在鏈霉菌中良好的TOL 質(zhì)粒）通過降解兒。該酶催化無色的鄰苯二酚（catechol）轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色

26、的 2-羥粘糠酸半醛，并可通過測定 375 nm 處吸收強度來定量。在平板上噴加底物鄰苯二酚可使陽性菌落呈黃色，因而是鏈霉菌中比較常用的系統(tǒng)之一（圖 2.15）。它有如下優(yōu)點：(1)廉價方便，培養(yǎng)基無需添加任何底物或者指示劑，顯色底物鄰苯二酚與常用的 -半乳糖苷酶底物 X-gaI 相比非常便宜；(2)靈敏快捷，可檢測出極微量的 C23O；(3) 可實現(xiàn)高通量檢測，C23O 的活性既可用極簡便的分光光度法定量測定，也可在 96 孔板里反應(yīng)，用多功能酶標(biāo)儀高通量檢測。17圖 2.15 利用 xylE 作為鏈霉菌中的Luciferase系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(

27、fireflyluciferase) 活性的一種系統(tǒng)。熒光素酶可以催化 luciferin 氧化成oxyluciferin，在 luciferin 氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過熒光測定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀測定 luciferin氧化過程中的生物熒光。綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)極大地方便了細(xì)胞生物學(xué)的研究。目前綠色熒光蛋白也廣泛地應(yīng)用霉菌的分子生物學(xué)研究當(dāng)中，尤其是形態(tài)分化的機制研究中。2鏈霉菌的遺傳操作系統(tǒng)鏈霉菌中常用的遺傳操作方法主要有 3 種：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合轉(zhuǎn)移。2.1.原生原生轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化包括 PEG 介導(dǎo)的原生轉(zhuǎn)化

28、和電擊轉(zhuǎn)化兩種方式。PEG 介導(dǎo)的原生轉(zhuǎn)化是鏈霉菌操作中最常用的方法。EG 介導(dǎo)的原生轉(zhuǎn)化是，在 PEG 幫助下質(zhì)粒將鏈霉菌菌絲成具有較高形成率和再生率的原生DNA 進(jìn)入原生。電擊轉(zhuǎn)化是通過對細(xì)胞懸液和 DNA 混合物施以瞬時高壓脈沖電流，導(dǎo)致細(xì)胞膜上出現(xiàn)短暫的通道，外源 DNA 通過這些通道進(jìn)入細(xì)胞。182.2.噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)是由噬菌體將一個細(xì)胞的 DNA 傳遞到另一個細(xì)胞的過程。鏈霉菌中常用的噬菌體為溫和型噬菌體C31，由他衍生的載體包括 KC505、KC515 等。2.3.接合轉(zhuǎn)移接合轉(zhuǎn)移是兩個細(xì)菌通過直接接觸，質(zhì)粒由一個細(xì)菌傳遞到另一個細(xì)菌的特異遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移過程。鏈霉菌中許多質(zhì)粒具有自

29、我轉(zhuǎn)移特性，如 pIJ101、SCP2、SCP1 等等。3.功能研究的方法3.1 鏈霉菌組 DN段的克隆3.1.1 基于文庫構(gòu)建的 DN段的克隆常見的文庫系統(tǒng)有 cosmid/fosmid 文庫，YAC 文庫和 BAC 文庫等。質(zhì)粒又稱粘粒(cosmid)，包括了大腸桿菌 E. coli的基本元件、包裝元件和抗性基因。其元件是 噬菌體的末端粘性位點(cohesive-end site，“cos”也是 cosmid名稱的由來)和包裝所需的序列。fosmid 質(zhì)粒的載體上含有單拷貝起始位點oriZ 和誘導(dǎo)性多拷貝起始位點 oriV，在沒有誘導(dǎo)劑的情況下 fosmid 在 trfA突變的宿主中為單拷

30、貝，在加入誘導(dǎo)劑的宿主或者含有 trfA的宿主中是多拷貝。其克隆外源 DN段的大小在 3145 kb 之間。BAC 是在大腸桿菌 F 因子的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。BAC 載體包括了 F 因子的嚴(yán)謹(jǐn)控制的子 oriS，解旋酶(RepE)起始位點，氯霉素抗性，三個確保低拷貝質(zhì)粒精確分配到子代細(xì)胞的座(parA、parB 和 parC)和 LacZ 元件。其片段理論值可以達(dá)到 300 kb 以上。3.1.2 Gibson 組裝在 DN段兩端與需要連接的 DN段兩端加上 39 bp 以上的同源區(qū)；將19片段加入外切酶反應(yīng)體系，DNA 雙鏈經(jīng)過 T5 外切酶外切后留下一定距離的 3突出；隨后 50 C 溫浴進(jìn)行

31、退火，同源臂配對；最后通過 PhuDNA polymerase互補鏈的空缺，Tag 連接酶連接 DN段的接口。圖 2.16 Gibson 組裝在原始鏈霉菌中，通過 Gibson 組裝了包含普那霉素生物簇的DN段，分 3 步完成，出發(fā)片段大小約 5 kb（圖 2.17）。圖 2.17 普那霉素簇的 Gibson 組裝3.1.3 Red/ET 同源重組首先選取合適的酶將含有目的簇的總組進(jìn)行酶切，與兩端含有同源臂的線性化載體混合，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大腸桿菌上含有同源重組所需要的各個元件(RecET 和 Red)；通過載體上的抗性標(biāo)記進(jìn)行篩選；提取質(zhì)粒驗證目的簇的序列和功能；最后對簇進(jìn)行改造或者異源表

32、達(dá)。20圖 2.18 Red/ET 系統(tǒng)克隆簇的過程3.1.4 酵母轉(zhuǎn)化偶聯(lián)的同源重組（TAR）酵母轉(zhuǎn)化偶聯(lián)的同源重組（Transformation-assotedbination，TAR）。在 TAR 載體的兩端包括有目的轉(zhuǎn)化宿主酵母菌，載體上和目的組的同源序列，將 TAR 載體和目的組共上的同源區(qū)便會在宿主中同源重組，目的基因便被克隆到 TAR 載體上。圖 2.19 TAR 系統(tǒng)的克隆過程利用 TAR 克隆系統(tǒng)，成功克隆了 taromycin A 的生物藍(lán)色鏈霉菌中表達(dá)獲得了特定產(chǎn)物（圖 2.20）。簇，并在天21圖 2.20 TAR 克隆系統(tǒng)在鏈霉菌中異源表達(dá)次級代謝產(chǎn)物簇3.1.5 基

33、于位點特異性重組的克隆通過兩次同源單交換在目的簇兩端引入特定的識別位點，其中一個載體序列在同源單交換后位于特定識別位點之間，導(dǎo)入特異的整合酶來識別所引入的位點，識別位點整合重組并環(huán)化，此時位點之間的載體發(fā)揮功能，目的片段便克隆到該載體上了。圖 2.21 FRT/Flp 介導(dǎo)的大腸桿菌大片段克隆223.1.6 通過接合轉(zhuǎn)移克隆大片段利用接合轉(zhuǎn)移過程中特定識別位點 oriT 克隆 DNA 大片段。首先構(gòu)建兩個片段 5端的同源臂、oriT 序列和其它篩選需要的元件，片段 3端的同源臂和 oriT 序列，通過兩次同源單交換到目的片段的兩端，然后通過接合轉(zhuǎn)移幫助質(zhì)粒從載體，一個包括目的另一個載體包括目的

34、將這兩個 oriT 分別其中一個 oriT 開始轉(zhuǎn)移 DNA 序列，過程在另一個 oriT 位點處停止，oriT 被重新整合環(huán)化，至此目的基同時這段序列轉(zhuǎn)移到受體菌中，在受體菌中因片段在受體菌中被克隆。圖 2.22通過接合轉(zhuǎn)移克隆大片段3.2敲除3.2.1 同源重組同源重組是外源 DNA 序列與受體細(xì)胞上的同源序列發(fā)生重組，從而改變細(xì)胞遺傳特性的方法。同源重組策略又分為通過單交換的阻斷和通過雙交換的敲除。23圖 2.23 通過單交換進(jìn)行阻斷圖 2.24 通過雙交換進(jìn)行敲除示意圖和突變株 PCR 驗證3.2.2 PCRPCRinging 技術(shù)是將一段攜帶與靶兩側(cè)各有 39 bp 同源序列的 PC

35、R 片段導(dǎo)入宿主菌細(xì)胞，在 Red 重組酶的作用下，線性 DN段與的特定進(jìn)行同源重組。Red 同源重組技術(shù)具有同源臂短、重組效率高的特點，可靶在上的任意位點進(jìn)行的點突變、敲除和敲入，不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶。24圖 2.25 PCRing 示意圖3.3 鏈霉菌組編輯3.3.1 I-SecI endonuclease 介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)敲除質(zhì)粒上含有一串聯(lián)的與靶片段左右臂同源的兩個 DN段以及 I-SecI識別的 18 個堿基的位點（s）。將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌細(xì)胞，并通過抗性篩選質(zhì)粒到組上的克隆。如果發(fā)生同源單交換，該質(zhì)粒將被完整導(dǎo)入組靶位點。通過誘導(dǎo)表達(dá) SecI，SecI 在 18 個堿基的

36、位點（s）切斷組 DNA，25菌體不能夠存活。如果發(fā)生同源雙交換， s被刪除，即使誘導(dǎo)表達(dá) SecI 也不會造成組 DNA 的斷裂，菌體仍然存活，并抗性敏感。圖 2.26 I-SecI endonuclease 介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)3.3.2 位點特異性整合酶介導(dǎo)的組編輯利用兩次同源單交換分別將兩個 loxP 位點整合到目的片段的上下游，再將 Cre 蛋白表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌，在 Cre 蛋白的作用下，兩個 loxP 位點發(fā)生位點特異性重組，完成目的片段的敲除。而環(huán)化的 DNA 由于不能在鏈霉菌中，隨著傳代而丟失。26圖 2.27 位點特異性整合酶介導(dǎo)的組編輯3.3.3 基于 FBT1 attp-

37、attB-整合系統(tǒng)的鏈霉菌組 DNA 大片段克隆技術(shù)通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將質(zhì)粒 pSV:attB6Up 導(dǎo)入鏈霉菌，卡那霉素篩選獲得 pSV:attB6Up 同源整合到目的位置的菌株 S-attB6。再將 pKC1139:attP6Dn 導(dǎo)入 S-attB6，在 40 度培養(yǎng)， pKC1139:attP6Dn 通過同源單交換整合到目的位置獲得S-attB6P6。通過結(jié)合轉(zhuǎn)移將含有 FBT1 整合酶的 pIJ10500 導(dǎo)入 S-attB6P6 中，利用整合酶將目的簇環(huán)出，并克隆到載體 pKC1139 上。圖 2.28 基于 FBT1 attp-attB-整合系統(tǒng)的鏈霉菌組 DNA 大片段克隆技術(shù)3.3

38、.4 CRISPR-Cas9 介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)CRISPR 是指規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(Clustered regularlyerspaced short27palindromic repeats)。CRISPR/CAS9 系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)細(xì)菌與所有的古菌中的一種后天免疫系統(tǒng)。II 型 CRISPR-Cas9 僅需 Cas9 核酸酶、成CRISPR-derived RNA 和 tranivating RNA 便可以對特定外源 DNA 序列進(jìn)行切割：CRISPR-derived RNA 和 tranivating RNA 的保守序列互補形成雜合分子，該雜合分子結(jié)合 Cas9 形成具有

39、活性的復(fù)合體，該復(fù)合體通過 CRISPR-derivedRNA 5端的 20 個堿基與靶 DNA 結(jié)合并進(jìn)行切割。2012 年 Doudna 等將CRISPR-derived RNA 和 tranivating RNA 融一條 RNA(sgRNA)，sgRNA具有引導(dǎo) Cas9 切割 DNA 的能力，為 CRISPR/CAS9 介導(dǎo)的礎(chǔ)。組編輯奠定了基具體做法是：首先優(yōu)化 cas9 的子，將其放置在強啟動子之后并克隆到敲除質(zhì)粒上，敲除質(zhì)粒上含有 sgRNA 并置于組成型啟動子之后， sgRNA 中的引導(dǎo)序列為靶位點的同源序列，敲除質(zhì)粒必須包括靶兩側(cè)的同源臂。將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌，CRISPR/C

40、as9 系統(tǒng)將靶位點切斷，同時質(zhì)粒上的同源臂與組上的同源臂發(fā)生雙交換，將斷裂的靶區(qū)刪除，阻重新連接。圖 2.29 鏈霉菌中 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用28圖 2.30 利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)開展鏈霉菌組編輯第二講 放線菌的生物學(xué)特性及其遺傳基礎(chǔ)習(xí)題：1，鏈霉菌具有哪些特點？2，應(yīng)用霉菌組編輯與大片段 DNA 克隆的技術(shù)都有哪些？能否用在你們今后的實驗中？主要參考文獻(xiàn)：1.Bentley SD, Chater KF, Cerdeo-Trraga AM, Challis GL, Thomson NR, James KD, HarrisDE, Quail MA, Kiese

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