生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、關(guān)于生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)第一張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)一總糖的測(cè)定蒽酮比色法第二張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)要求掌握蒽酮比色定糖法的原理和方法掌握72型分光光度計(jì)的原理和操作方法學(xué)習(xí)通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定未知物含量的方法第三張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)原理糖類在較高溫度下經(jīng)濃無機(jī)酸作用脫水產(chǎn)生糠醛或糠醛衍生物，可與蒽酮縮合成藍(lán)綠色化合物，顏色深淺與糖量成正比。本法多用于測(cè)定糖原含量，也可用于測(cè)定葡萄糖含量。第四張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果1、制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線2、測(cè)定樣品含糖量計(jì)算100克小麥面粉中總糖含量第五張，PPT

2、共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)二氨基酸的分離鑒定紙層析法第六張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)要求學(xué)習(xí)分配層析法的原理掌握氨基酸紙上層析的操作技術(shù)（包括點(diǎn)樣、平衡、展層、顯色及鑒定）第七張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)原理紙層析法是以濾紙作支持物，紙纖維上的羥基具有親水性，能吸附一層水作固定相，而與水不相混合的有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，因此利用分配層析原理，不同物質(zhì)在兩相間有不同的分配系數(shù)而在紙上移動(dòng)的距離不同，即被分開。本實(shí)驗(yàn)分離的是混合氨基酸樣品，層析之后用茚三酮試劑顯色。第八張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果1、點(diǎn)樣2、展層3、顯色用鉛筆描出

3、顯色斑點(diǎn)的形狀，測(cè)其距離并計(jì)算各氨基酸的Rf 值。第九張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)三蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定及沉淀反應(yīng)第十張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)要求 了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法通過實(shí)驗(yàn)加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)區(qū)分可逆沉淀反應(yīng)及不可逆沉淀反應(yīng)并了解其實(shí)用意義了解蛋白質(zhì)變性及沉淀的關(guān)系第十一張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其解離狀態(tài)和程度受溶液的酸堿度影響。在等電點(diǎn)（pI）時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)有變化，可利用性質(zhì)的變化測(cè)定蛋白質(zhì)pI。常用的方法是測(cè)其溶解度最低時(shí)的溶液p

4、H值。本實(shí)驗(yàn)借觀察在不同pH溶液中的溶解度以測(cè)定酪蛋白的等電點(diǎn)。操作：用醋酸和醋酸鈉配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。第十二張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)原理：蛋白質(zhì)是一類高分子化合物，分子大小已達(dá)膠體顆粒范圍（1100毫微米）,因此蛋白質(zhì)在水溶液中具有膠體的性質(zhì)。維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素有兩個(gè)：一是膠體顆粒所帶的電荷，一是與介質(zhì)水形成的水化膜。這種穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的，在一定物理化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷、脫水，甚至變性而喪失穩(wěn)定因素，從溶液中析出，這種作用稱為蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。

5、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類：1）可逆沉淀反應(yīng)：如鹽析作用，等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)等。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常用此類反應(yīng)。2）不可逆沉淀反應(yīng)：如重金屬鹽、生物堿試劑、過酸、過堿、加熱、震蕩、超聲波、有機(jī)溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀而析出。 第十三張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月操作1蛋白質(zhì)的鹽析作用2重金屬沉淀蛋白質(zhì) 3有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)4有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)5生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì) 第十四張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)四血清球蛋白的分離、純化及鑒定第十五張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)要求初步學(xué)會(huì)分離、純化蛋白質(zhì)的常用方法并了解其原理。學(xué)習(xí)鹽析、層析基本原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

6、 掌握電泳基本原理，熟悉操作方法，了解影響電泳的因素。 第十六張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)原理（一）血清球蛋白的分離血清蛋白質(zhì)先用鹽析初步分離。半飽和硫酸銨可沉淀血清球蛋白而白蛋白不被沉淀，離心后白蛋白主要集中在上清液中，而球蛋白主要在沉淀中。將球蛋白沉淀溶于少量水中，裝于透析袋，透析除去硫酸銨。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液，在0.0175摩爾/升pH6.3磷酸緩沖液條件下加到DEAE纖維素柱上，在此pH下，DEAE纖維素帶正電荷，能吸附帶負(fù)電荷的白蛋白、-及-球蛋白，僅球蛋白不能吸附而直接流出。第十七張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(二) 血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠垂直板狀電泳

7、利用聚丙烯酰胺凝膠作電泳支持物。聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，是由丙烯酰胺單體和少量交聯(lián)劑在催化劑、加速劑的作用下發(fā)生聚合反應(yīng)而制得的，利用電泳和分子篩的雙重作用分離物質(zhì)，分辨力較高。血清蛋白在紙上電泳可分為57個(gè)組分，而在聚丙烯酰胺電泳上可分出1225個(gè)組分。 第十八張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一） 血清球蛋白的分離純化1硫酸銨鹽析 ：注意應(yīng)緩慢滴入飽和硫酸銨溶液并邊加邊搖，避免局部濃度過高。2透析脫鹽：用納氏試劑檢查水中NH4+，直至硫酸銨全部透析完畢。 3DEAE纖維素柱層析：裝柱、平衡柱床、上樣、洗脫收集。4檢查洗脫液中蛋白質(zhì)：磺基水楊酸檢查，出現(xiàn)白色沉淀

8、即有蛋白質(zhì)析出。合并蛋白質(zhì)含量高的洗脫液，以備鑒定。第十九張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二） 血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠垂直板狀電泳1凝膠板的制備：板狀電泳槽按要求夾好、固定，用1%瓊脂封邊，并按比例配制凝膠，灌入凝膠板。2樣品的準(zhǔn)備：樣品中加入樣品稀釋液，內(nèi)含溴酚蘭為示蹤染料。3電泳：將上電泳槽的電極接電泳儀的負(fù)極，下電泳槽接正極，調(diào)節(jié)電壓為150伏，電泳約1小時(shí)。 4剝膠5固定、染色、脫色 第二十張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果將分離純化的蛋白質(zhì)收集，經(jīng)電泳分離并與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作對(duì)照，繪出電泳圖譜。第二十一張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 五

9、維 生 素 C 的 定 量 測(cè) 定2，6-二 氯 酚 靛 酚 法 第二十二張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)要求學(xué)習(xí)定量測(cè)定維生素C的原理和方法。掌握微量滴定法的基本操作技術(shù)。第二十三張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 原 理維生素C又名抗壞血酸，是水溶性維生素，具有很強(qiáng)的還原性，在堿性和微酸性環(huán)境中，能還原2，6-二氯酚靛酚成無色的還原型2，6-二氯酚靛酚，同時(shí)自身被氧化成脫氫抗壞血酸。氧化型的2，6-二氯酚靛酚在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色，當(dāng)用2，6-二氯酚靛酚滴定含有抗壞血酸的酸性溶液時(shí)，在抗壞血酸尚未全部被氧化時(shí)，滴下的2，6-二氯酚靛酚立即呈現(xiàn)無色，當(dāng)溶液從無色

10、轉(zhuǎn)變成微紅色時(shí)，即表示溶液中的抗壞血酸剛剛?cè)勘谎趸?，此時(shí)即為滴定終點(diǎn)，可以算出被檢物質(zhì)中抗壞血酸的含量。第二十四張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果1、提取維生素C2、用2，6-二氯酚靛酚鈉溶液滴定標(biāo)準(zhǔn)維生素C，計(jì)算1毫升2，6二氯酚靛酚溶液相當(dāng)于抗壞血酸多少毫克。3、用2，6-二氯酚靛酚鈉溶液滴定樣品維生素C，計(jì)算100克樣品所含維生素C的毫克數(shù)。4、注意事項(xiàng)：滴定過程必須迅速 。第二十五張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 六肝臟堿性磷酸酶的提取及活力測(cè)定 第二十六張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)要求學(xué)習(xí)和掌握有機(jī)溶劑沉淀法提取堿性磷酸酶的原

11、理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。掌握以磷酸苯二鈉為底物測(cè)定堿性磷酸酶活力的原理和方法。 第二十七張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 原 理堿性磷酸酶（Alkaline plosphatase,簡(jiǎn)稱AKP或ALP）是磷酸酶中的一種，廣泛存在于生物體中，參與物質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑分步沉淀法提取AKP，即利用樣品中各種不同的成分在不同的有機(jī)溶劑中溶解度不同，反復(fù)進(jìn)行沉淀、溶解而達(dá)到分離純化的目的。第二十八張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月酶分離純化后需測(cè)定活力。比活性是指單位重量的酶蛋白樣品中所含的酶活性單位，隨著酶蛋白逐步純化，其比活性將隨之升高，因此測(cè)定酶的比活性可鑒定酶的純化程

12、度。AKP屬水解酶，在堿性條件下（pH910）能水解多種磷酸酯。以磷酸苯二鈉作為酶的底物，水解產(chǎn)生的酚與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化可產(chǎn)生紅色醌類衍生物，根據(jù)紅色深淺通過分光度法測(cè)定酶活性。AKP蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定?？捡R斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)結(jié)合生成藍(lán)色復(fù)合物，在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與顏色深淺成正比。第二十九張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果（一）AKP的提取勻漿 抽提 丙酮、乙醇反復(fù)沉淀 AKP純酶液注意事項(xiàng)：所用有機(jī)試劑必須預(yù)先預(yù)冷。提取過程中所有有機(jī)試劑濃度應(yīng)計(jì)算準(zhǔn)確，加量準(zhǔn)確。各階段提取液需取出部分待測(cè)比活性。第三十張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于20

13、22年6月（二）AKP比活性測(cè)定 1、 樣品酶活性測(cè)定：酶活性單位計(jì)算：在37下保溫15分鐘產(chǎn)生1毫克酚，稱為該酶的1個(gè)活性單位（U）。計(jì)算每毫升酶液的酶活性單位（U/mL）2、樣品酶蛋白含量測(cè)定：計(jì)算每毫升酶液的蛋白含量（mg/ml） 3、比活性計(jì)算：比活性（ U/mg）=每毫升酶液的酶活性單位/每毫升酶液的蛋白含量4、注意事項(xiàng)：注意各階段的稀釋倍數(shù)及取樣量。各管加樣量要準(zhǔn)確，注意反應(yīng)時(shí)間。第三十一張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 七堿性磷酸酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 第三十二張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)要求了解酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究內(nèi)容及意義 通過檢測(cè)不同溫度條件

14、下AKP的活性，了解溫度對(duì)酶活性的影響學(xué)習(xí)測(cè)定酶最適pH的方法，了解pH對(duì)酶活性的影響了解底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響，學(xué)習(xí)測(cè)定米氏常數(shù)（Km）的原理和方法。 第三十三張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 原 理酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)，如底物濃度、酶濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等，進(jìn)行酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。酶的催化作用受溫度的影響。當(dāng)溫度達(dá)到某一定值時(shí)，酶促反應(yīng)達(dá)到最高峰，此溫度稱為酶的最適溫度。 第三十四張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月酶的活力受環(huán)境pH的影響極為顯著。通常只有在一定的pH范圍內(nèi)，酶才表現(xiàn)

15、其催化活性，且在某一pH時(shí)，酶的活性才達(dá)最大值，稱為最適pH值，不同酶的最適pH值不同。在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對(duì)酶的催化作用有很大的影響。一般情況下，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，酶促反應(yīng)速度（V）隨底物濃度（S）的增加而迅速增加；但當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時(shí)，反應(yīng)速度的增加率就比較小；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾又聊撤N程度時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值（Vm）。Km值是酶的一個(gè)特征常數(shù)，是反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。Km可以近似表示酶與底物的親和力，測(cè)定Km是酶學(xué)研究的一個(gè)重要方法。 第三十五張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、溫度對(duì)酶活性的影響2、pH對(duì)酶活性的影響3、底物濃

16、度對(duì)酶活性的影響（Km的測(cè)定） 第三十六張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、比較各種溫度對(duì)AKP酶活性的影響，確定其最適溫度。 2、比較各種pH對(duì)AKP酶活性的影響，確定其最適pH值。3、以酶活性單位代表各管中酶反應(yīng)速度(v)作縱坐標(biāo)，以底物濃度（s）為橫坐標(biāo)，連接各點(diǎn)，觀察該圖形的形狀。以酶活性單位的倒數(shù)（1/v）為縱坐標(biāo)，底物濃度的倒數(shù)（1/s）為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙描出各點(diǎn)并連接，求該酶的Km值。第三十七張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 八 胰島素和腎上腺素對(duì)血糖濃度的影響第三十八張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)要求了解胰島素及腎上腺素調(diào)節(jié)機(jī)體

17、血糖濃度的機(jī)理與效果學(xué)會(huì)制備無蛋白血濾液掌握磷鉬酸比色法測(cè)定血糖的原理和方法 第三十九張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 原 理人和動(dòng)物體內(nèi)，血糖濃度受各種激素調(diào)節(jié)而維持恒定。胰島素促進(jìn)肝臟和肌肉將葡萄糖合成糖原，又加強(qiáng)糖的氧化作用，故可以降低血糖；腎上腺素促進(jìn)肝糖原分解而增高血糖。葡萄糖的醛基具有還原性，與堿性銅試劑混合加熱后，被氧化成羧基，而堿性銅試劑中的二價(jià)銅則被還原成磚紅色的氧化亞銅沉淀，氧化亞銅又可使磷鉬酸還原生成鉬藍(lán)，使溶液呈藍(lán)色，其藍(lán)色深淺與葡萄糖的濃度成正比。 第四十張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果1、激素的作用：動(dòng)物準(zhǔn)備 取空腹血注射激素

18、后取血 2、血糖的測(cè)定：無蛋白血濾液的制備測(cè)定血糖計(jì)算：樣品的血糖含量(毫克%)注意事項(xiàng)：血糖測(cè)定反應(yīng)在取血后2小時(shí)內(nèi)完成，放置過久，糖易分解，使含量減低。磷鉬酸試劑宜貯于棕色瓶中，如出現(xiàn)藍(lán)色，表明試劑本身已被還原，不能用。堿性銅試劑中有氧化亞銅沉淀，也不能用。第四十一張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 九 肝 細(xì) 胞 DNA 的 制 備及 含 量 測(cè) 定第四十二張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)要求學(xué)習(xí)和掌握濃鹽法從肝細(xì)胞中提取DNA的原理操作技術(shù)學(xué)習(xí)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA含量的原理和操作方法熟悉紫外分光光度計(jì)的基本原理和使用方法學(xué)習(xí)定糖法（二苯胺法）測(cè)定DNA含

19、量的原理和操作技術(shù) 第四十三張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí) 驗(yàn) 原 理DNA的制備：DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的。動(dòng)物和植物組織的脫氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或濃鹽溶液（如1摩爾/升氯化鈉），但在0.14M鹽溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白（RNP）則溶于稀鹽溶液,利用這一性質(zhì)可將DNP與RNP以及其他雜質(zhì)分開。分離得到DNP之后，必須將其中蛋白質(zhì)除去。用十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，使DNA與蛋白質(zhì)分開，然后用氯仿-異戊醇乳化蛋白質(zhì)，離心除去變性蛋白質(zhì)，再用乙醇抽提DNA。第四十四張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA含量測(cè)定：DNA具有吸收紫外

20、光的性質(zhì)，吸收高峰在260毫微米波長處。核酸的消光系數(shù)（或吸收系數(shù)）用(p)表示，即每升含有一克原子核酸磷的光吸收值（即A值），因此，用紫外分光法測(cè)定核酸含量時(shí)規(guī)定：在260毫微米波長下，每毫升含1微克DNA溶液的消光值（即O.D.260）為0.020,而每毫升含1微克RNA溶液的O.D.260值為0.022,故測(cè)定未知濃度DNA溶液的O.D.260，即可計(jì)算出DNA的含量。DNA被酸水解后生成的脫氧核糖可以與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595毫微米處有最大吸收。DNA在40400微克范圍內(nèi)，光密度與DNA濃度成正比。第四十五張，PPT共五十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果 1、DNA的制備：肝臟勻漿離心正丁醇脫脂SDS使DNP中DNA游離氯仿-異戊醇使蛋白質(zhì)變性和溶解脂類離心乙醇沉淀DNA 無水乙醇反復(fù)DNA注意事項(xiàng)：勻漿程度和次數(shù)需嚴(yán)格限制。勻漿目的是破壞細(xì)胞膜，避免破壞細(xì)胞核。必須加入足夠量的SDS。攪拌應(yīng)小心，緩慢，避免將D