深低溫保存血小板制備與質(zhì)量控制

1、深低溫保存血小板制備與質(zhì)量控制 由于冰凍保存血小板有良好的臨床止血效果和可根據(jù)需要長期大量庫存的優(yōu)點(diǎn)，理想的血小板冰凍保存技術(shù)研究日益受到關(guān)注。血小板是成份輸血的重要部分，它對各種原因引起的血小板減少，起到了藥物不可替代的治療作用。血小板的臨床止血效果，與所輸注的血小板數(shù)量和質(zhì)量關(guān)系密切。正確掌握冰凍保存血小板的整個制備過程中的制備技術(shù)和質(zhì)量控制方法，才能提高我們制備的血小板的得率和質(zhì)量。簡單流程離心機(jī)冰箱血小板全血ACD200ml采血袋全血全血簡單流程血小板DMSO-80冰凍血小板血小板5%DMSO血小板37循環(huán)式水浴箱冰凍血小板血小板DMSO所需儀器設(shè)備超濾DMSO裝置G6漏斗、電動吸引器

2、全自動血細(xì)胞計數(shù)儀德國Heraeus離心機(jī)Cryofuge 8000或6000I超凈工作臺血細(xì)胞分離機(jī)-80低溫冰箱38循環(huán)式水浴箱分漿夾、熱合機(jī)24G頭皮針一次性10ml無菌注射器稱量儀、自動加樣器冰凍保護(hù)劑DMSO準(zhǔn)備G6漏斗、收集瓶、分裝瓶的準(zhǔn)備將G6漏斗、收集瓶、分裝瓶先用長水沖洗，硫酸-高錳酸鉀液浸泡24小時，流水沖洗后用雙蒸水沖洗、浸泡，然后包裝，通過高壓蒸汽消毒（136，6-8分鐘）。超濾后500ml/瓶分裝好避免光，置于潔凈環(huán)境室溫保存。DMSO的超濾和保存在無菌間，超凈工作臺中，將購置的DMSO用G6漏斗負(fù)壓抽濾。冰凍血小板制備方法 從全血采集到制備血小板的全過程，均要求在2

3、22環(huán)境中6小時內(nèi)完成（包括離心溫度）。即使不立即制備，也不要將全血放入冰箱4保存，以免影響血小板質(zhì)量。冰凍血小板制備方法冰凍血小板制備方法新鮮富含血小板血漿（FPRP）制備最佳離心分離條件選擇 離心是制備冰凍富含血小板血漿最重要的環(huán)節(jié)之一。選擇最佳離心條件的目的，是為了使獲得的富含血小板血漿中血小板濃度較高，而紅細(xì)胞、白細(xì)胞污染少。選擇最佳離心條件的方法需要根據(jù)各單位的具體條件來確定。最佳離心條件選擇方法 我科采用析因設(shè)計確定最佳離心條件。測定ACD全血、FPRP內(nèi)血小板計數(shù)和FPRP體積，計算所得血小板數(shù)和血小板得率，確定最佳離心條件。冰凍血小板制備方法 室溫(18-22左右)條件下，用三

4、聯(lián)采血袋采集健康獻(xiàn)血者ACD-B抗凝全血200ml。要求采血流暢，采血時間3min。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明采用德國Heraeus Cryofuge 8000和6000I離心機(jī)，加速度為9檔，減速度為4檔的條件下，在400-650g離心5-11min 血小板得率較高。冰凍血小板制備方法冰凍血小板制備方法二因素離心力離心時間400g480g560g650g5min7min9min11min四水平組合成16種離心條件 通過計算各條件下血小板得率，同時參考白細(xì)胞和紅細(xì)胞污染率，選取最佳離心條件。冰凍血小板制備方法冰凍血小板制備方法結(jié)果 222條件下，采用德國Heraeus Cryofuge 8000離心機(jī)，加速度

5、為9檔，減速度為4檔，480g，離心7min條件下，平均得率為70%。紅細(xì)胞污染1109/單位；白細(xì)胞污染5107/單位。冰凍血小板制備方法 從ACD全血離心制備的FPRP質(zhì)量，不僅與離心機(jī)的離心速度有關(guān)，而且與血液體積、血球壓積、離心機(jī)啟動加速度和減速度密切相關(guān)。其中離心機(jī)性能非常重要。冰凍血小板制備方法 由于離心后ACD全血中的紅細(xì)胞壓得不緊，容易因?yàn)檎駬u和非勻速運(yùn)動而泛起，混入FPRP中。共振明顯的離心機(jī)不適于制備富含血小板血漿。合適的離心機(jī)減速度檔選擇低檔較好。冰凍血小板制備方法 離心時要采取措施如仔細(xì)系綁等，防止血袋在離心杯內(nèi)出現(xiàn)皺折或塌伏，減少分離時紅細(xì)胞污染。冰凍血小板制備方法

6、離心完畢，要輕拿輕放，盡量減少搬動次數(shù)。最好將離心好的血液直接從離心杯中輕輕轉(zhuǎn)移到分漿夾中。分離上層FPRP應(yīng)該用止血鉗控制速度。速度以慢為好，至少要先快后慢。否則將會減少血小板得率，增加紅細(xì)胞和白細(xì)胞污染。冰凍血小板制備方法添加冰凍保護(hù)劑DMSO二甲基亞砜在冰凍血小板中作用冰凍血小板制備方法 二甲基亞砜（DMSO）:化學(xué)試劑、分析純、分子式：C2H6OS、分子量：78.13，凝點(diǎn)約18.3-18.5、沸點(diǎn)：189-192，比重：1.099-1.109g/ml,為無色稀薄液體、略帶苦味，易吸潮、具特殊臭味（大蒜樣味）。冰凍血小板制備方法 本藥品口服及皮膚給藥均易吸收，皮下注射4-8小時，一部分

7、以原形從尿中排泄、還有少部分經(jīng)肺排出。冰凍血小板制備方法 DMSO在冰凍血小板中主要作為一種防凍劑，保護(hù)血小板膜。在緩慢加入DMSO時，DMSO將血小板包圍起來，既起到保護(hù)作用又可抑制血小板的凝集、聚合作用。冰凍血小板制備方法 DMSO有抑菌作用，DMSO濃度為8%時，能抑制92%的綠膿桿菌生長、濃度為15%時，能抑制的大腸桿菌和巨大芽胞桿菌生長、但高濃度使用本品不能代替滅菌。冰凍血小板制備方法 DMSO使用前要經(jīng)G6漏斗濾除雜物、細(xì)菌、熱原質(zhì)等。裝放在潔凈無菌的玻璃瓶中，室溫保存。DMSO添加方法 離心后輕輕分離上層新鮮PRP（FPRP），經(jīng)過稱量，在潔凈的環(huán)境中采用無菌技術(shù)，用一次性10m

8、l注射器和24G頭皮針緩慢（5min）加入超濾DMSO，終濃度為5% 。冰凍血小板制備方法需要添加DMSO量的簡單計算方法：DMSO（ml）=富含血小板血漿（ml）0.05在加入DMSO過程中，要用一定強(qiáng)度充分混勻，避免局部產(chǎn)熱。盒裝后直接放入-85冰箱保存。冰凍血小板制備方法冰凍血小板制備方法 5%DMSO在室溫下2-3小時內(nèi)對血小板通常無明顯毒性作用。加入5%DMSO后，血小板激活標(biāo)志物CD62p（P選擇素）和磷脂酰絲氨酸陽性率稍微增加，這與DMSO加入方式有關(guān)。冰凍血小板制備方法 將高濃度的DMSO加入FPRP中會有局部產(chǎn)熱現(xiàn)象，如果加入過快，可使局部溫度過高，引起血小板激活。冰凍血小板

9、制備方法 CD62p陽性率升高幅度與DMSO添加的速度和混合方式密切相關(guān)。過快的添加速度和劇烈振蕩可以使CD62p陽性率明顯升高。在DMSO加入的過程中，人工添加要求采取正確的振蕩方式和合適的添加速度。最好采用機(jī)械自動加入和自動搖床，有利于操作標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制。富含血小板血漿質(zhì)控 檢測獻(xiàn)血者外周血血小板計數(shù) 要求獻(xiàn)血者PLT150109/L 要求分離后血小板個數(shù)2.01010個/袋 紅細(xì)胞污染1109/U 白細(xì)胞污染5107/U 每月抽樣5袋，做血小板，白細(xì)胞 紅細(xì)胞計數(shù)，細(xì)菌培養(yǎng)，及五項(xiàng)實(shí)驗(yàn) （ALT，HBsAg，HCV，HIV，USR）機(jī)采濃縮血小板冰凍保存 取機(jī)采新鮮濃縮血小板，在潔凈的環(huán)境中采用無菌技術(shù)，用一次性10ml注射器和24G頭皮針往血小板收集袋中