PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光儀操作維護(hù)程序

1、PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光儀操作維護(hù)程序1目的：使PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀能夠正確和正常的使用，保證擴(kuò)增及結(jié)果分析的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。2適用范圍：PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀。3負(fù)責(zé)人：1 操作人：1 1 1 4. 性能參數(shù):見說明書。5. 操作程序：51 擴(kuò)增反應(yīng)前須先在PE5700 SDS 軟件的設(shè)置面板上按照事先排好的標(biāo)本位置進(jìn)行設(shè)置。每次實驗除了待檢標(biāo)本，還要包括一個陰性對照、一個陽性對照、一個陽性室內(nèi)質(zhì)控品、一組陽性標(biāo)準(zhǔn)品（4個梯度104、105、106、108）。52 依次打開電腦顯示器和電腦主機(jī)的電源開關(guān)，進(jìn)入Windows NT界面。53 接著打開光源檢測器和P

2、CR儀電源開關(guān)，預(yù)熱5分鐘。 54 點擊PE 5700 SDS 圖標(biāo)，打開軟件。55 在New plate Application 窗口分別選定5700/SYBR Green， 然后單擊OK，打開一空白設(shè)置面板。56 在Setup 版面設(shè)定樣品種類與名稱，數(shù)量。561 在Type欄中選擇類別：STND標(biāo)準(zhǔn)梯度，UNKN未知樣品， NTC陰性對照，Not in use未使用562 再在Name欄中依次輸入樣品名稱。563 在框定所選標(biāo)準(zhǔn)梯度孔數(shù)后，需在工具欄中單擊P窗口，選定PR1 primer SYBR后，關(guān)閉窗口，可見所選孔左下角有一長方形陰影。564 在框定所選孔數(shù)后，在工具欄中單擊Q窗口

3、，即可在此窗口輸入定值標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)量。57 點擊Instrument 即可在此窗口設(shè)定循環(huán)參數(shù)。58 選定任務(wù)欄File中的Save項，彈出對話框。在對話框中的File Name項下輸入一組數(shù)字和（或）字母組成的文件名，選Save。59 檢查設(shè)置正確與否，運行程序591 在設(shè)置完程序文件的Instrument窗口，點RUN鍵，即可運行。592 反應(yīng)結(jié)束后，選任務(wù)欄File中的Save項，保存實驗結(jié)果。510 關(guān)閉PE 5700 序列檢測器開關(guān)，再關(guān)擴(kuò)增儀開關(guān)。511 結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)程序：對于5700結(jié)果曲線的分析，應(yīng)按以下步驟進(jìn)行：全部曲線陰性對照陽性對照陽性室內(nèi)質(zhì)控品陽性標(biāo)準(zhǔn)品逐個分析（標(biāo)出陽

4、性標(biāo)本和可疑標(biāo)本）調(diào)整參數(shù)，獲得較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示定量結(jié)果登記，發(fā)報告。5111 整體曲線的觀察,將所有曲線選中進(jìn)行整體觀察.a)觀察是否存在污染情況（包括標(biāo)本污染和試劑污染），特別應(yīng)注意大量曲線在同一Ct值出現(xiàn)上漲的情況。b)觀察是否有光路傳導(dǎo)阻滯或電壓波動等機(jī)器原因形成的異常曲線。5112 陰性對照的分析陰性對照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陰性標(biāo)本。作用：用以監(jiān)測實驗室和前處理過程中是否存在污染。5113 陽性對照的分析陽性對照：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知陽性標(biāo)本。作用：用以監(jiān)測實驗?zāi)芊裾z出陽性標(biāo)本，避免假陰性的出現(xiàn)。5114 陽性室內(nèi)質(zhì)控品的分析陽性室內(nèi)質(zhì)控

5、品：試劑中加入與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理的已知或未知濃度的陽性室內(nèi)質(zhì)控血清。作用：用以監(jiān)控日常實驗的精密度。5115 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的分析a)各梯度曲線的分布是否均勻，若各梯度曲線均未分開，則表明陽性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋可能存在問題，提示實驗中存在較大人為誤差。b)觀察各曲線的Ct值是否在平日的正常位置：情況1：若出現(xiàn)低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品做不出，而各曲線Ct 值均后移，則判斷是否為試劑擴(kuò)增效率下降（如試劑過期或保存條件不合格）。情況2：出現(xiàn)低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品做不出，而高拷貝曲線Ct值均正常，則提示可能存在低拷貝陽性標(biāo)準(zhǔn)品的降解情況。c) 每日必做102標(biāo)準(zhǔn)品，用作以下三方面監(jiān)控：一 是否存在操作誤差，如加樣量過少等原因?qū)е?

6、02標(biāo)準(zhǔn)品未能檢出；二 是否存在稀釋后的梯度放置過久，低拷貝標(biāo)準(zhǔn)品降解的情況；三 若高拷貝標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)Ct值后移，且能排除情況A、B，則判斷是否為試劑靈敏度下降。5116 單個曲線的判斷逐個分析每條曲線，判斷曲線的陰陽性或?qū)倏梢汕€。（可疑標(biāo)本是指曲線在27個Ct值后出現(xiàn)上漲且平臺趨勢不明顯或上漲幅度比較低的標(biāo)本?？梢蓸?biāo)本要第二天重做，兩次結(jié)果一致則報陽性，否則結(jié)果報陰性。）曲線觀察內(nèi)容：在基線選擇28時觀察Rn值大小（是否有三期特征）。在基線選擇00時觀察Rn值曲線形狀。5117 得出定量結(jié)果調(diào)節(jié)基線和閾值以得到一較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。電腦據(jù)此曲線給出陽性結(jié)果值。此時應(yīng)排除某些陰性標(biāo)本因熒光曲線假性

7、上揚(yáng)而得出的假陽性結(jié)果和某些弱陽性標(biāo)本因終末熒光值過低而顯示的假陰性。5118發(fā)放報告及時登記檢測結(jié)果記錄，發(fā)放臨床報告。5.12.維護(hù)和校準(zhǔn)程序：5.121 微軟Windows NT工作站的維護(hù)硬盤驅(qū)動器每月29日左右運行一次碎片清除程序，使用Norton Utilities或類似軟件。具體步驟：a）放入Norton Utilities光盤。b）從My Computer打開Norton Utilities軟件光盤。c）啟動清理碎片/優(yōu)化程序。d）運行完成后，檢查以確信無嚴(yán)重錯誤記錄，退出Norton Utilities。e）取出Norton Utilities光盤，重新啟動計算機(jī)。5.122

8、 PCR儀的維護(hù)5.1221 樣品槽的清潔樣品槽每月進(jìn)行一次清潔，如出現(xiàn)樣品槽污染情況則隨時清潔。操作方法：a）運行25HOLD程序使樣品槽溫度達(dá)到室溫。關(guān)閉儀器，等待10分鐘。b）從樣品槽移去樣品架。c）在樣品槽中加入少量濃度95%乙醇，用尼龍棉簽或塑料桿擦洗反應(yīng)孔。d）用干棉簽吸干乙醇。e）在PE 5700光源檢測器未蓋住樣品槽時，打開PCR儀，并升溫到50運行10分鐘，以蒸發(fā)掉多余的乙醇。5.1222 熱蓋的清潔熱蓋每月進(jìn)行一次清潔，如有需要隨時進(jìn)行。a）運行25HOLD程序使樣品槽溫度達(dá)到室溫。關(guān)閉儀器，等待10分鐘。b）逆時針旋轉(zhuǎn)PE 5700光源檢測器頂部旋鈕。向后推PE 5700

9、光源檢測器至滑軌距離的大約1/3處。c）PE 5700光源檢測器滑軌上有缺口。從這些缺口垂直抬起PE 5700光源檢測器，小心側(cè)放于儀器頂蓋上。不要從儀器取走熱蓋。d）用經(jīng)過濃度95%乙醇濕潤的鏡頭紙或脫脂棉球清潔加熱蓋，待干。e）將PE 5700光源檢測器重新安裝回滑軌。5.1223 PE 5700光路系統(tǒng)的維護(hù)5.12231 調(diào)準(zhǔn)ROI參照條調(diào)準(zhǔn)ROI參照條在儀器更換鹵素?zé)?、儀器定期校準(zhǔn)或儀器維修后進(jìn)行。不得由一般實驗人員進(jìn)行該項操作。a）PCR儀樣品槽中放入熒光檢測板。b）將PE 5700光源檢測器向前拖動蓋住樣品槽，并旋緊。c）從Start菜單選擇運行PE 5700 SDS管理軟件。d

10、）積分時間從512ms開始，用位置調(diào)整點，調(diào)節(jié)ROI的高度與右邊線。e）逐漸增加積分時間，直到可以看到至少四個塊（約4096ms）。f）調(diào)整最左側(cè)位置調(diào)整點。g）減少積分時間到1024ms，調(diào)整上方與底部的位置調(diào)整點。h）減少積分時間以便最右側(cè)塊可見但未飽和（約512ms），調(diào)節(jié)最右側(cè)位置調(diào)整點。如有需要用右上角拖動點調(diào)整圖像的傾斜度（以左上角為中心旋轉(zhuǎn)）。i）調(diào)節(jié)后的參照條寬度必須在ROI參照塊間有小空隙。5.12232 校正ROI光路ROI光路校正每月進(jìn)行一次，以便確信結(jié)果仍然是優(yōu)化的。a）在PCR儀樣品槽中放入熒光檢測板。b）將PE 5700光源檢測器向前拖動蓋住樣品槽，并旋緊。c）從S

11、tart菜單選擇運行PE 5700 SDS管理軟件。d）點選Show ROI復(fù)選框。每個樣品孔周圍出現(xiàn)一藍(lán)色橢圓圈。e）點選Show Saturation復(fù)選框。f）設(shè)定積分時間為1024ms；打開鹵素?zé)艉凸忾l。g）點擊LIVE按鈕獲取圖像，然后在任何地方左擊停止。獲取中等程度未飽和圖像（無紅色圖像）。h）從Edit菜單中選擇Calibrate ROIs每個孔都會選取合適的ROI，確定96孔都被藍(lán)色橢圓圈正確界定。i）圖像太亮太暗都會出現(xiàn)錯誤信息，相應(yīng)增加或減少積分時間，并重復(fù)上述第8步直到無錯誤信息出現(xiàn)。j）檢查孔ROI位置，所有孔信息都應(yīng)包含在96個ROI橢圓圈中。如果沒有，重復(fù)8和9步。

12、5.12233 檢查PCR儀樣品槽的熒光污染檢查PCR儀樣品槽的熒光污染每月進(jìn)行一次，如有需要隨時進(jìn)行。a）開啟PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀電源。b）從Start菜單選擇運行PE 5700 SDS管理軟件。c）從樣品槽中移去反應(yīng)板。d）將PE 5700光源檢測器向前拖動蓋住樣品槽，并旋緊。e）設(shè)定積分時間為256ms；打開鹵素?zé)艉凸忾l。f）點擊LIVE按鈕獲取圖像，然后在任何地方點擊停止。g）觀察96孔中背景熒光。如孔有顯著熒光則表示該孔存在熒光污染。h）按照樣品槽的清潔程序清洗樣品槽。5.12234 更換鹵素?zé)魞x器使用大約2000小時后應(yīng)更換鹵素?zé)?但具體要視鹵素?zé)魧嶋H情況而定。a）關(guān)

13、閉PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀，冷卻15分鐘。b）移去PE 5700光源檢測器頂蓋。c）移去鹵素?zé)繇斏w。d）把舊燈泡從插座中滑出，更換新鹵素?zé)簟４_信燈正確安裝在位置上。滑動燈泡時要輕輕抬起燈以避開裝配螺絲釘。e）重新裝上燈頂蓋和PE 5700光源檢測器頂蓋。f）開啟PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀電源，運行PE 5700 SDS管理軟件。g）通過軟件控制鹵素?zé)糸_關(guān)，確認(rèn)燈隨開關(guān)開閉。h）開啟光閘，確認(rèn)光閘可打開。i）設(shè)定積分時間為1024ms，點擊LIVE。保證可以采集一幅數(shù)據(jù)圖像。j）若新鹵素?zé)舨还ぷ?，PE 5700電源保險管可能有問題。5.123 校準(zhǔn)PE 5700型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀為復(fù)雜精密儀器，其校準(zhǔn)工作需由專業(yè)工程師進(jìn)行。實驗室應(yīng)與儀器廠家達(dá)成協(xié)議，定期（一般每年一次）校準(zhǔn)儀器。平時通過對室內(nèi)質(zhì)控圖的分析，發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)果出現(xiàn)系統(tǒng)誤差后，又經(jīng)過分析排除了試劑和人員誤差，應(yīng)懷疑是否儀器出現(xiàn)了檢測偏差從而需要校準(zhǔn)。實驗室人員根據(jù)上述“光路系統(tǒng)的維護(hù)”部分的內(nèi)容調(diào)節(jié)光路，可初步確定儀器是否光路原因引起的檢測偏差，通過光路調(diào)節(jié)解決問題。若問題不出在光路系統(tǒng)，則應(yīng)聯(lián)系儀器廠家派技術(shù)人員來進(jìn)行校準(zhǔn)。注意事項：a）儀器應(yīng)放置在水平堅固的平臺上，外界電源系統(tǒng)電壓要匹配，并要求有良好的接地線。b）環(huán)境溫度保持在23左右，濕度保持在60左右。c）儀器應(yīng)每月底清潔維護(hù)。d