淀粉酶及可溶性糖的測(cè)定

1、水稻種子萌發(fā)后淀粉酶活力的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)原理】種子中貯藏的糖類主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉酶分解為麥芽糖2（C6H10O5）n+nH2OnC12H22O11淀粉麥芽糖麥芽糖有還原性，能使3,5-二硝基水楊酸還原成棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸：產(chǎn)物3-氨基-5硝基水楊酸呈棕色，可用分光光度計(jì)測(cè)定。休眠種子的淀粉酶活力很弱，種子吸賬萌動(dòng)后，酶活力逐漸增強(qiáng)，并隨著發(fā)芽天數(shù)的增長(zhǎng)而增加。【儀器、材料與試劑】（一）儀器分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫箱、恒溫水浴鍋、25mL刻度試管、乳缽、離心管（二）材料水稻種子、芽糖、淀粉、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、細(xì)砂、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（

2、Na2HPO4）、氯化鈉（NaCI）、氫氧化鈉（NaOH）（三）試劑TOC o 1-5 h z1.1g/L標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液20mL精確稱量100mg麥芽糖，用少量水溶解后，移入100mL量瓶中，用蒸餾水定容。2.0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.9）100mL0.2mol/L磷酸二氫鉀67.5mL與0.02mol/L磷酸氫二鉀82.5mL混合，稀釋10倍。3.10g/L淀粉溶液100mL1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中，其中含有0.0067mol/L氯化鈉。4.10g/L3,5-二硝基水楊酸試劑100mL1g3,5-二硝基水楊酸溶于20mL2mol/L的氫氧化鈉

3、溶液和50mL水中，再加入30g酒石酸鉀鈉，定容至100mL。若溶液渾濁，可以過(guò)濾。5.10g/L氯化鈉溶液300mL6.細(xì)砂5g【實(shí)驗(yàn)步驟】種子發(fā)芽種子浸泡處理后，放入培養(yǎng)皿中在人工氣候室內(nèi)發(fā)芽。酶液提取取發(fā)芽4天左右的幼苗15株，放入乳缽內(nèi)，加入細(xì)砂200mg，加10g/L氯化鈉溶液10mL，用力磨碎。在室溫下放置20min，攪拌幾次。然后將提取液1500r/min離心6-7min。將上清液倒入量筒，測(cè)定酶提取液的總體積。進(jìn)行酶活力測(cè)定時(shí)，用緩沖液將酶提取液稀釋10倍。另取未萌發(fā)的水稻種子15粒作為對(duì)照（提取步驟同上）。酶活力測(cè)定（1）取25mL刻度試管8支，編號(hào)。按下表要求加入各試劑（各

4、試劑須要在25C預(yù)熱10min）。1234、試官標(biāo)號(hào)試劑、5種顏色照射下發(fā)芽種子的酶提取液各一支（紅色、綠色、黃色、白色、黑色）未明發(fā)種子的酶的提取液標(biāo)準(zhǔn)管空白管酶液/mL0.50.5標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液/mL0.510g/L淀粉溶液/mL1.01.01.01.0水/mL0.5將各管混勻，放在25C水浴中，保溫3min后立即向各管中加入100g/L3,5-二硝基水楊酸溶液2mL。（3）取出各試管，放入沸水浴中加熱5min。冷卻至室溫加水稀釋至25mL。將各管充分混勻。4）用空白管作對(duì)照，在500nm處測(cè)定各管的吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.將500nm波長(zhǎng)處讀取的數(shù)值填入下、表：試管號(hào)15種顏色照射下發(fā)芽

5、種子的酶提取液各一支（紅色、綠色、黃色、白色、黑色）2未明發(fā)種子的酶的提取液3標(biāo)準(zhǔn)4空白A500nm2.關(guān)于麥芽糖濃度的計(jì)算根據(jù)溶液的濃度與吸光度值成正比的關(guān)系，即：Ac標(biāo)準(zhǔn)式中,c為濃度；A為吸光度標(biāo)準(zhǔn)A準(zhǔn)二c標(biāo)準(zhǔn)，則c（酶液管中麥芽糖的濃度）=未知未知值。規(guī)定：25C時(shí)3min內(nèi)水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。則15粒種子的總活力單位=C酶x口酶酶式中，C酶為酶液中麥芽糖的濃度；n酶為酶液稀釋倍數(shù)；V為提取酶液的總體積酶水稻種子萌發(fā)后可溶性糖的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)原理】糖類遇濃硫酸脫水生成糖醛或其衍生物，反應(yīng)如下OHOHCHCHHO-CH-CH-OH濃h：so4H-CHCH(?H

6、G亡HC対Q十HOCHCHOH:農(nóng)H2SO4HO-CHCHCHOHO亡際CCHO+SHiO牲甲歯奴能已甜糠醛或羥甲基糠醛進(jìn)一步與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生藍(lán)綠色物質(zhì)，其在可見(jiàn)光區(qū)620nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且其光吸收值在一定范圍內(nèi)與糖的含量成正比關(guān)系。此法可用于單糖、寡糖和多糖的含量測(cè)定，并具有靈敏度高，簡(jiǎn)便快捷，適用于微量樣品的測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)?！緦?shí)驗(yàn)材料、儀器及試劑】（一）材料培養(yǎng)4天左右的水稻種子、未萌發(fā)的水稻種子（二）儀器分光光度計(jì)、恒溫水箱、20mL試管（3支）、漏斗、100mL容量瓶、刻度試管、試管架、研缽（三）試劑：（1）100pg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖：AR級(jí)葡萄糖100mg，蒸餾水溶解，定容至10

7、00mL。（2）蒽酮試劑：0.2g蒽酮，溶于100mL濃硫酸中。當(dāng)日配制使用。棕色瓶避光處貯藏。（3）濃硫酸?！緦?shí)驗(yàn)步驟】葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支20mL試管，編號(hào)，按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。在每管中均加入4mL蒽酮試劑，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管完成后一起浸于沸水浴中，管口加蓋，以防蒸發(fā)。置沸水浴中煮沸10min，取出冷卻至室溫，在620nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)各管溶液的光密度值（OD），以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。管號(hào)1234567標(biāo)準(zhǔn)匍萄糖原液（mL）（100pg/mL）00.20.30.40.50.60.8蒸餾水1.00.80.70.60.

8、50.40.2葡萄糖含量（pg）0203040506080樣品中可溶性糖的提取稱取1g發(fā)芽種子，置于研缽中，加入少量蒸餾水，研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入試管中，用L0mL蒸餾水分次洗滌研缽，洗液一并轉(zhuǎn)入刻度試管中。置沸水浴中加蓋煮沸10分鐘，冷卻后過(guò)濾，濾液收集于100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。其余4種顏色照射下發(fā)芽種子的提取液各一份，提取步驟同上。（紅色、綠色、黃色、白色、黑色）糖含量測(cè)定用移液管吸收1mL提取液于試管中，加入4.0mL蒽酮試劑。蓋上試管塞后，輕輕搖勻，再置沸水浴中10min（比色空白用1mL蒸餾水與4.0mL蒽酮試劑混合，并一同于沸水浴保溫10min）。冷卻至室溫

9、后，在波長(zhǎng)620nm下比色，記錄光密度值。查標(biāo)準(zhǔn)曲線上得知對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量（Mg）【結(jié)果計(jì)算】樣品含糖量（g/100g鮮重）=X100查表所得含糖量（gx稀釋倍數(shù)樣品重（g）xlO6水稻種子的蛋白酶活性測(cè)定【實(shí)驗(yàn)材料】水稻種子（萌發(fā)、未萌發(fā)）各濃度酪氨酸溶液（10-60）磷酸緩沖液（pH=7.8）：磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）6.02g和磷酸二氫鈉（NaH2PO42H2O）0.5g,加水溶解定容至1000mL,pH計(jì)校正；0.4mol/L三氯乙酸溶液：稱取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL;1%酪蛋白溶液：稱取酪蛋白1.000g，精確至0.001g，用1020mL0.5

10、mol/L氫氧化鈉溶液濕潤(rùn)后，加入磷酸緩沖液約60mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌,直至完全溶解，冷卻后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用磷酸緩沖液定容，此溶液在4C保存，有效期為三天；福林試劑：于1000ml的圓底燒瓶中，加入20g鎢酸鈉（），5g鉬酸鈉（）和140ml蒸餾水，再加入10ml85%磷酸（）及20ml濃鹽酸，充分混合，加入沸石防暴沸。使用回流裝置微沸2h,回流結(jié)束及冷卻后，加入300g硫酸鋰（），10ml蒸餾水及2-3滴溴，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱煮沸15min（不必回流），驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后加蒸餾水到200ml，過(guò)濾，保存于玻塞棕色瓶中備用。所制成的試劑應(yīng)為淡黃色而不帶綠色。使用前用標(biāo)準(zhǔn)NaOH

11、滴定（酚酞做指示劑），算出酸的濃度。然后適當(dāng)稀釋，約加水一倍，使最終的酸濃度為1mol/L左右?！緦?shí)驗(yàn)步驟】樣品的采集與處理:分別取兩種水稻種子10粒于研缽中,加入少許石英砂以及2mL0.1mol/L、pH7.8的磷酸緩沖液研碎,經(jīng)研磨至勻漿狀態(tài),再加入3mL同樣的磷酸緩沖液,繼續(xù)研磨至勻漿,此為酶液,備用。磷酸鹽緩沖液稀釋3倍后備用。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取不同濃度酪氨酸（10-60）酪氨酸溶液各1ml,分別加入0.5mol/L碳酸鈉溶液5ml,福林試劑1ml，置于28C恒溫水浴中顯色15min，用空白管（只加水、碳酸鈉溶液和福林試劑）做對(duì)照，利用分光光度計(jì)在680nm處測(cè)吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)

12、，以酪氨酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（做兩組及以上平行試驗(yàn)以保證準(zhǔn)確性）。酶活性測(cè)定吸取1%酪蛋白溶液2ml置于試管中，在28C水浴中預(yù)熱5min后加入預(yù)熱（28C水浴5min）的酶液1ml，立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)10min后，由水浴中取出，并立即加入0.4mol/L三氯乙酸溶液3ml，放置15min后，用濾紙過(guò)濾。同時(shí)另做一對(duì)照管，即取酶液1ml先加入3ml0.4mol/L三氯乙酸溶液，然后再加入1%酪蛋白溶液2ml。28C水浴保溫10min,放置15min,過(guò)濾。取三支已經(jīng)編號(hào)的試管，分別加入樣品濾液、對(duì)照濾液和水各1ml。然后加入0.5mol/L碳酸鈉溶液5ml,混勻后再各加入福林試劑1ml,立

13、即混勻，在28C顯色15min。以加水管為空白，在680nm處測(cè)對(duì)照及樣品的吸光度值。計(jì)算酶活力：規(guī)定在28C，pH7.8的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生酪氨酸為一個(gè)活力單位,則水稻種子蛋白酶在28C，pH7.8的條件下所具有的活力單位為：式中，為樣品液吸光度值；為対照液吸光度值；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線上吸光度值為1時(shí)的酪氨酸質(zhì)量（）；t為酶促反應(yīng)的時(shí)間（min），本次t=10min；V為酶促反應(yīng)管的總體積（ml），本次實(shí)驗(yàn)V=未定；N為酶液的稀釋倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)N=2000（可適當(dāng)調(diào)整）。種子活力的測(cè)定逐日統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率,7d后將幼苗烘干稱重，取其單株幼苗的平均干重，計(jì)算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。發(fā)芽指數(shù)=工/（是t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，是相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)）;活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)X幼苗