ILKmRNA在結腸癌細胞株中的表達及其穩(wěn)定表達的RNA干擾載體構建

1、ILKmRNA在結腸癌細胞株中的表達及其不變表達的RNA滋擾載體構建【摘要】目的檢測結腸癌細胞株中ILK的RNA程度，并構建針對ILK基因的特異性RNA滋擾(RNAi)表達載體。要領通過RT-PR檢測ILK基因在三種結腸癌細胞株S480、L-V及HT29RNA的表達；根據(jù)GenBank提供的ILK基因RNA序列，方案具有小發(fā)夾布局的兩條DNA序列，化學合成后經(jīng)退火形成雙鏈DNA片斷，毗連到經(jīng)HindBgl酶切線性化的pSUPER-ne-EGFPH1pSNE/H1質粒上，形成重組載體pSNE-ILK，轉化大腸桿菌DH5，提取質粒經(jīng)Hind/ER雙酶切斷定和測序斷定，不變轉染結腸癌細胞HT29。結

2、果RT-PR檢測，ILK基因在三種結腸癌細胞株中均有表達，ILK/-atin電泳條帶強度比：S480為0.63，HT29為0.65，L-V為0.33。樂成構建了針對ILK基因的特異性RNA滋擾載體pSNE-ILK和比較的無關基因載體pSNE-ntrl，并不變轉染結腸癌細胞株HT-29。結論樂成構建了針對ILK基因的特異性RNAi載體，并不變轉染HT29細胞，能有用按捺ILK基因，為下一步探究ILK基因在結腸癌歷程中的作用和結腸癌的基因治療奠基了基?！娟P鍵詞】RNA滋擾載體構建RT-PR整合素毗連激酶ExpressinfILKRNAinlnarinaellLinesandnstrutinfILK

3、-RNAiStableExpressingVetrKeyrds：RNAinterferene；vetrnstrutin；RT-PR；integrin-linkedkinase免疫染色強度與腫瘤細胞的浸潤深度、淋巴轉移以及腫瘤的分級、分期呈正相干7。RNA滋擾RNAinterferene，RNAi8是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA所誘導的一種特異性的轉錄后基因沉默沉靜征象，它是通過落解具有同源序列靶基因的RNA，到達制止基因表達的作用，使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型的歷程，具有高特異性、高不變性、高服從性、高穿透性、能同時按捺多個基因等特性9。RNAi是基因沉默沉靜的抱負東西，可以直接用于疾病相

4、干基因的按捺，從而到達疾病治療或防范的目的。本實行是通過RT-PR技能，檢測ILKRNA在結腸癌細胞系中表達環(huán)境，并構建其特異性的RNA滋擾載體，按捺ILK基因表達，為結腸癌基因治療提供了理論根據(jù)。1質料與要領11細胞株、質粒及菌株結腸癌細胞株S480、HT29、L-V細胞為本實行室保存。含EGFP的pSUPER-nesiRNA表達載體pSNE由本校戚華兵博士、何建明博士惠贈；大腸埃希菌DH5為本實行室保存。12重要試劑限定性內(nèi)切酶Hind、Bgl和ER為NeEnglandBilab公司產(chǎn)物；RT-PR試劑盒、T4DNA毗連酶、DL2000DNAarker及-HindDNAarker為TaKa

5、Ra公司產(chǎn)物；質粒DNA提取純化試劑盒和膠接納試劑盒為BiDev公司產(chǎn)物；H-DE造就基為Hylne公司產(chǎn)物；新生牛血清為民海公司產(chǎn)物；G418為ARES公司產(chǎn)物；TRIzl、Lipfetaine2000為Invitrgen公司產(chǎn)物。引物均由上海生工公司合成。13要領131結腸癌細胞總RNA的提取接納TRIzl法抽提總RNA詳細要領拜見Invitrgen公司的TRIzl說明書。132RT-PR133RNA滋擾載體的構建根據(jù)報道ILKsiRNA序列10及已頒發(fā)的基因庫中ILK基因的RNA序列，利用軟件方案，根據(jù)ligengine提供的pSUPER-RNAiSyste中構建發(fā)夾狀短鏈RNA的原那么

6、，53別離為Bgl酶切位點靶向公理鏈發(fā)夾狀布局靶向反義鏈停頓序列Hind酶切位點，方案為：sensEiLK為：5-GATTGTTGAGTTGTAGGTTAAGA-GATGAGAAGTAAGAGTTTTTA-3，antisenseILK為：5-AGTTAAAAATGTTGAGTTGT-AGGTTTTGAATGAGAAGTAAGAGGG-G-3。無關基因比較組sense-ntrl為：5-GATTGTTGAGTTGTAGGTTAAGAGA-TGAGAAGTAAGGATTTTTA-3，antisense-ntrl為：5-AGTTAAAAATGTTGAGTTGT-AGGTTTTGAATGAGAAGTAA

7、GAGGG-G-3。將合成的單鏈稀釋為3g/l，退火成雙鏈，于4保存。用Bgl及Hind雙酶切質粒pSNE，1.0%瓊脂糖凝膠電泳30in，純化接納線性化質粒pSNE根據(jù)BiDev膠接納試劑盒說明書舉行。T4DNA毗連酶毗連線性化質粒pSNE和退火產(chǎn)物，以線性化質粒pSNE和滅菌水毗連做陰性比較。4毗連留宿后轉化大腸桿菌DH5感覺態(tài)細胞感覺態(tài)細胞制備和轉化參照?分子克隆指南?，在氨芐青霉素抗性的LB平板上37造就留宿挑選，隨機挑取菌落，擴增造就后，抽提并純化質粒，用ER及Hind雙酶切，1.0瓊脂糖凝膠電泳斷定陽性為281bp，陰性為227bp。酶切斷定準確的進一步測序斷定。134RNA滋擾載

8、體細胞轉染應用Lipfetaine2000轉染結腸癌細胞HT-29。轉染前一天，用0.25胰酶溶液消化對數(shù)生恒久的HT-29細胞，制成單細胞懸液，接種到24孔板中，接種密度約莫為1.5105/孔，每孔參加500l含20%小牛血清的H-DE造就液。轉染步調詳見Invitrgen的Lipfetaine2000產(chǎn)物利用說明書。轉染48h后可在熒光顯微鏡下不雅察到綠色熒光。以1000g/l濃度的G418壓力挑選，以未轉染的HT-29細胞為陰性比較。得到不變表達的HT-29/pSNE-ILK細胞后，做RT-PR進一步驗證滋擾服從，滋擾服從1-滋擾組/比較組100%。135統(tǒng)計學要領各項計量資料均以xs表

9、現(xiàn)，應用SPSS13.0版統(tǒng)計闡發(fā)軟件舉行數(shù)據(jù)闡發(fā)，接納t查驗，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果21ILKRNA在結腸癌細胞系中的表達經(jīng)RT-PR擴增，ILK基因擴增片斷長度為406bp，-atin擴增片斷長度為500bp，與實行方案切合。電泳結果直接用Bi-Rad凝膠拍照體系保存，用BandSan軟件舉行闡發(fā)，2條帶光密度比(ILK/-atin)為基因表達的相對值：S480細胞為0.63，HT29細胞為0.65，均高表達；L-V細胞為0.33，中度表達見圖1。22表達載體的構建及斷定退火產(chǎn)物與線性化載體毗連后，轉化大腸菌DH5，平板上有數(shù)十個菌落生長，陰性比較無菌落生長，各隨機取4個菌落

10、，擴大造就后，抽提質粒，以Hind和ER雙酶切闡發(fā)雙酶切pSNE質粒作為陰性比較。此中14號為pSNE-ILK質粒，58號為pSNE-ntrl質粒，910號為pSNE質粒。2、3、4、5、7號質粒能被切出281bp巨細的片斷，8、9、10號能被切出227bp巨細的片斷見圖2。送4、5號質粒到上海生工測序，測序結果證明載體pSNE-ILK及比較載體pSNE-ntrl構建樂成見圖3。23RNA滋擾載體的細胞轉染熒光顯微鏡不雅察3討論對付中晚期結直腸癌患者，最重要的治療本領是化療，而化療結果卻不盡人意，基因治療成為如今研究較熱門的要領之一。RNA滋擾技能是通過落解具有同源序列靶基因的RNA，到達基因

11、敲除，進而制止該基因表達的作用，使細胞表現(xiàn)出特定基因表型缺失的歷程8，9。ILK是一種新近創(chuàng)造的絲/蘇氨酸卵白激酶8，到場多種信號傳導通路。很多研究證明ILK是調治體內(nèi)很多生物歷程如增殖、黏附、凋亡和轉移的樞紐點4，5。外洋研究表現(xiàn)，ILK的表達量與前線腺腫瘤、玄色素瘤、卵巢癌的形成嚴密相干，且表達量的凹凸與腫瘤細胞的惡性程度、浸潤和轉移本領呈正相干7，1114。如今已有研究表現(xiàn)，通過按捺ILK來按捺PKB的活性，可以或許導致大腸癌細胞的步伐性殞命和G1S期細胞周期的停滯15，因此，我們推測，ILK大概成為以后治療結腸癌的一個抱負靶點16。我們通過本實行證明，在差異結腸癌細胞系中，ILKRNA

12、均有表達，而且表達強度均在中度以上，這與外洋相干報道同等4，5。而正常結腸內(nèi)膜中，ILK無表達或表達極其薄弱，無法測出4，5，17。因此我們推測ILK在結腸癌的形成和轉移中大概起著非常緊張的作用，而如今阻斷ILK基因的抗體大概藥物非常稀疏，而且非常昂貴，因此我們構建針對ILK基因的特異性RNA滋擾載體，阻斷ILK基因的表達，以到達基因沉默沉靜的結果，為研究ILK基因在結腸癌的作用開發(fā)了新的途徑。本實行中，我們樂成構建了針對ILK基因的RNAi載體pSNE-ILK，并不變轉染HT29細胞，經(jīng)G418壓力挑選，得到不變表達細胞系HT29/pSNE-ILK。經(jīng)RT-PR證明，pSNE-ILK對ILK

13、基因有明顯的滋擾作用，可以滿意實行要求。這為下一步探究ILK基因在結腸癌的基因研究及治療中的作用提供了新思緒?！緟⒖嘉墨I】1HanniganGE,LeungHagestEijn,FitzGibbnL,etal.Regulatinfelladhesinandanhrage-dependentgrthbyanebeta1-integrin-linkedprteinkinaseJ.Nature,1996,379(6560):91-96.2u,DedharS.Integrin-linkedkinase(ILK)anditsinteratrs:aneparadigfruplingfextraellula

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