常見分子操作基本步驟

1、常見分子操作基本步驟 TOC o 1-5 h z 1、總 RNA 的提?。?BIOZOL 法提取） 12、植物種胚中RNA 的提?。?CTAB - LiCl 提取法） 33、兩步法RT-PCR 44、瓊脂糖核酸電泳7 HYPERLINK l bookmark0 o Current Document 5、膠回收純化DNA （AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒） 96、連接（T 載體連接） 117、連接（ T4 酶連） 128、感受態(tài)細(xì)胞的制備（大腸桿菌） 139、質(zhì)粒DNA 的提取（堿裂解法） 1510、酶切 16 HYPERLINK l bookmark6 o Current Docume

2、nt Ni 柱純化 His-tag 蛋白質(zhì) 17非變性條件下抽提His-Tag 蛋白質(zhì) 17變性條件下從包涵體中純化 His-Tag 的蛋白質(zhì) 21NTA 樹脂的再生231、總 RNA 的提?。?BIOZOL 法提?。闹参锝M織分離RNA 的質(zhì)量至關(guān)重要，包括RNA 的純度和完整性。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNaseW污染。但RNase舌性 非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性 Rnas的卜，環(huán)境中也存在大量 Rnasa外源性的Rnas帝在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于 灰塵中。在其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的 Rnas曲會(huì)造成污染。這些 外源性的Rnas可污染器械、玻璃制品、塑料制品、

3、電泳梢、研究人員的手及各種試劑。 而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的Rnase。因此在提取RNA時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無Rnase勺環(huán)境，包括去除外源性Rnase虧染和抑制內(nèi)源性Rnase舌性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性Rnase,通過Rnasel勺阻抑蛋白R(shí)nas用口強(qiáng)力的 蛋白質(zhì)變性劑如異硫富酸月瓜抑制內(nèi)源性 Rnase （注：BIOZOL溶液包 含異硫氰酸胍和苯酚，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)格外小心）。在收集到生物材料之后，最好能即刻進(jìn)行RNA 制備工作。若需暫時(shí)儲(chǔ)存，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲(chǔ)存于-80 C冷凍柜。在制備 RNA 時(shí)， 將儲(chǔ)存于冷凍柜的材料取出， 立即以加入液氮研

4、磨的方式打破細(xì)胞，不可以先行解凍，以避免 RNases作用。步驟：（ 1）提取植物組織RNA 前，應(yīng)先將研磨用的器具洗凈； 研磨前用液氮將所有器具及待用的滅菌EP管預(yù)冷，避免樣品潮解；（2）用液氮將上述組織研磨后迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的 EP管中，每50100mg組織用1 ml BIOZOL試劑對(duì)組織進(jìn)行裂解，立即混勻，在室溫 1530 C下放置5分鐘；(3)在上述EPf中，按照每1 ml BIOZOL力口0.2 ml氯仿的量(1/5體 積)加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下(15 30 C)放置 23分鐘后，12000g (2 8 C)離心 15 分鐘；(4)取上層水相置于新EP

5、管中，加入等體積異丙醇(每1 ml BIOZOL 約力口0.6 ml異丙醇)，-20 C放置103陰鐘，12000g (2 C8 C) 離心 10分鐘；(5)棄上清，加1 ml 75 %乙醇進(jìn)行洗滌，輕輕混合，7500g (2 C 8 C)離心5分鐘，棄上清；(6)讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；(7)用 Rnase-free wateWi? RNA 沉淀。2、植物種胚中RNA 的提取( CTAB - LiCl 提取法)植物總 RNA 提取技術(shù)是一項(xiàng)植物分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)， 而某些植物組織中富含多糖、 脂質(zhì)及酚類物質(zhì)， 往往不利于RNA 的分離和純化，因此 能否有效地去除多糖和脂質(zhì)是提取

6、高質(zhì)量植物 RNA 成敗的關(guān)鍵 。 CTAB-LiCl 提取法可在不用液氮的室溫下有效地排除剝?nèi)》N胚中大量帶有的多糖和本身脂質(zhì)的干擾，并進(jìn)一步滿足RT-PCR等實(shí)驗(yàn)的需要，適用于富含多糖和脂質(zhì)的植物組織 RNA 提取。步驟：(1)在 1. 5 ml EP管中力口入700 區(qū)曲RNA提取液(2 % CTAB (w/v), 內(nèi)含2 %5 % PVP (w/v) ,100 mmol/L Tris - HCl (pH8.0), 25 mmol/L EDTA (pH8.0)和2.0 mol/L NaCl,滅菌，使用前加入 &航基乙醇使 其終濃度為2 %5 % (v/v),并置于65 C水浴鍋中溫育0.5

7、 h以上；( 2)將滅菌鑷子剝?nèi)〉乃痉N胚直接加入RNA 提取液，滅菌玻璃棒搗碎，渦旋混合，繼續(xù)在65 C溫育10 min ;(3)加入等體積的氯仿+異戊醇，渦旋混勻后4 C 10000g離心10 min, 用滅菌槍頭小心剔除漂浮的脂肪層，吸取上清；( 4)重復(fù)上述步驟，并在合并的上清中加入1/4體積的 10 mol/L LiCl溶液并混勻，4 C條件下過夜，使RNA沉淀；(5)次日，于4 C, 10000 rpm離心20 min,棄上清；(6)用 Rnase-free wate溶解 RNA;(7)再加入0.1體積3 mol/L的NaAc和2.5體積95 %乙醇，置于-20 C 環(huán)境下 30m

8、in 使 RNA 沉淀；(8) 4 C, 10000 rpm再次離心20 min,棄上清，最后用70 %的乙醇 清洗沉淀，吹干后用Rnase-free wate溶解RNA沉淀，保存于-20 C 冰箱中備用。3、兩步法RT-PCR步驟：第一步：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)( TaKaRa AMV 酶法)( 1)將以下實(shí)驗(yàn)材料混勻后，離心， 65 C 5 min ，立即冰水浴，稍離心，以去除二級(jí)結(jié)構(gòu)Reagent （反應(yīng)物）Quantity, for 20 l q of reaction mixtureOligo (dT)1 010 mM dNTP mix2 0RNase Free dH2O5 0實(shí)驗(yàn)樣品RNA (

9、12 g)2 lTotal10 0/Sample（2）將以下材料混勻，離心，42 C 2 h,最后95 C 10min （使AMV變性），混勻離心后-20 C保存。ReagentQuantity, for 20 l q of reaction mixture5 AMV buffer4 0AMV0.5 l pRNase Free dH2O5.5 l pTotal20 0/Sample第二步：PCR反應(yīng)(1)按下列組成在PC皈應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液ReagentQuantity, for 20 l q of reaction mixture火菌水14.6 L10 Taq Buffer2 025 mM M

10、gCl 21.2 l p10 mM dNTP mix0.4 l p1上游引物10 pmol/口0.3 l p下游引物10 pmol/口0.3 l pTaq酶0.2 l pcDNA模板1 0Total20 0/Sample(2)按以下條件進(jìn)行反應(yīng)rStepTemperature, CTime, minNumber ofcyclesNote預(yù)變性9451f變性940.5r退火溫度比理論退火溫退火37-650.525-35度大概低5 C,再根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化根據(jù)擴(kuò)增Taq酶每分鐘延伸72產(chǎn)物的大延伸1000 bp小最終延伸721014、瓊脂糖核酸電泳(1)用蒸儲(chǔ)水將制膠模具和梳子沖洗干凈， 擦干后放在

11、制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；(2)根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi)，定量加入電泳緩沖液(TBE);(3)放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，冷卻片刻(以不燙手為宜)，倒入電泳梢中，待其凝固；(4)室溫下30分鐘左右凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳梢內(nèi)；(5)向電泳梢中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣 品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；(6)在DNA樣品中加入6 x體積的載樣緩沖液(loading buffer), 混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi)；(7)接通電

12、源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記 DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)(靠近加樣孔的一端為負(fù))。一般60100V電壓，電泳20 40min即可；(8)根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳；(9)電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置, 并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的最佳分辨范圍(bp)0.5 %1,00030,0000.7 %80012,0001.0 %50010,0001.2 %4007,0001.5 %2003,0002.0 %50 2,0005、膠回收純化 DNA (AxyPrep DNA 凝膠

13、回收試劑盒)一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備(1)、第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定體積的無水 乙醇。(2)、準(zhǔn)備無核酸和核酸酶污染的 Tip頭、離心管。(3)、準(zhǔn)備75 C水浴。(4)、使用前，檢查Buffer DE-B是否出現(xiàn)沉淀，若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)于 70 C溫浴加熱溶解并冷卻至室溫后再使用。二、操作步驟(1)、在紫外燈下切下含有目的 DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠 表面液體并切碎。計(jì)算凝膠重量(提前記錄離心管重量)，該重量 作為一個(gè)凝膠體積(如100 mg=100 w體積)。(2)、加入3個(gè)凝膠體積的Buffer DE-A ,混合均勻后于75 C加熱(低 熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠于

14、40 C加熱)，間斷混合(每2-3 min),直至凝 膠塊完全熔化(約6-8 min)。* Buffer DE-A為紅色溶液。在熔化凝膠的過程中，可以幫助觀察凝 膠是否完全熔化。(3)、加0.5個(gè)Buffer DE-A體積的Buffer DE-B ,混合均勻；當(dāng)分離的 DNA片段小于400 bp時(shí)，加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇。*加Buffer DE-B后混合物顏色變?yōu)辄S色，充分混勻以保證形成均一的黃色溶液。(4)、吸取步驟3中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2 ml (試齊 盒內(nèi)提供)離心管)中，12,000 xg離心1 min。棄濾液。(5)、將制備管置回2 ml離心管，力口 500 Buf

15、fer W1 , 12,000 x g離 心30 s,棄濾液。(6)、將制備管置回2 ml離心管，力口 700區(qū)Buffer W2 , 12,000 x g離 心30 s,棄濾液。以同樣的方法再用 700屋Buffer W2洗滌一次 12,000 x g 離心 1 min。確認(rèn)在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無 水乙醇。兩次使用 Buffer W2 沖洗能確保鹽份被完全清除，消除對(duì)酶切反 應(yīng)的影響。(7)、將制備管置回2 ml離心管中，12,000Xg離心1 min。(8)、 將制備管置于潔凈的 1.5 ml 離心管(試劑盒內(nèi)提供) 中， 在制備膜中

16、央小心加入25-30 “ Eluent或去離子水，室溫靜置1 min; 12,000 x g離心1 min洗脫DNA。將 Eluent 或去離子水加熱至65將提高洗脫效率。三、注意事項(xiàng)(1)、在步驟 1 中，將凝膠切成細(xì)小的碎塊可大大縮短凝膠熔化時(shí)間(線型 DNA 長(zhǎng)時(shí)間暴露在高溫條件下易于水解) ，從而提高回收率。勿將含 DNA 的凝膠長(zhǎng)時(shí)間地暴露在紫外燈下，減少紫外線對(duì)DNA 造成的損傷。(2)、在步驟2中凝膠必須完全熔化，否則將嚴(yán)重影響 DNA回收率(3)、將Eluent或去離子水加熱至65 C,有利于提高洗脫效率。(4)、DNA 分子呈酸性，建議在 2.5 mM Tris-HCl ,

17、pH 8.5洗脫液中保存。流程圖含有口的DNA凝膠計(jì)算凝膠體積I加Buffer DE-A.溫浴75熔化凝咬TT熔化加含 0.5 個(gè) Buffer DE-A 體枳的 Buffer DE-BL加 500 pj Buffer W1加 700 W Buffer W2加 700 . Buffer W2加25-30川Eluent或公離子水6、連接(T載體連接)經(jīng)Taq DNA聚合酶擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物末端都帶有單個(gè)A。正是基 于這一原理，pMD19-T質(zhì)粒經(jīng)EcoR V切成平端后，在開口端加上一 個(gè)T制成T載體，一方面避免了自身環(huán)化，另一方面由于 T-A互補(bǔ)，從 而提高了 T載體與PCR產(chǎn)物之間的連接效率。

18、由于 T-A克隆只需純化 PCR產(chǎn)物，因而操作較為簡(jiǎn)便。步驟：(1)在PCR管中加入如下成分:ReagentQuantity, for 10 lof reaction mixturepMD19-T Vector0.5 l pSolution I5 0DNA片段4.5 l pTotal10 0/Sample(2)混勻樣品并短暫離心，將離心管置于 4 C連接過夜；連接完的樣品可直接用于轉(zhuǎn)化，也可放4 C冰箱短期保存。7、連接(T4酶連)(1)連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度(載體與片段的摩爾比為1:31:5為宜)。(2)在PCR管中加入如下成分：ReagentQuantity, for 10

19、 lof reaction mixture10X T4 連接 Buffer1 0DNA片段約 0.3 pmol載體約 0.1 pmolT4連接酶0.5 l pdH2OAdd up to10 l /Sample(3)混勻樣品并短暫離心，將離心管置于 4 C連接過夜(或16 C連 接46 hr);連接完的樣品可直接用于轉(zhuǎn)化，也可放 4 冰箱短期保 存。8、感受態(tài)細(xì)胞的制備(大腸桿菌)一、菌種純化(1)使用LB平板培養(yǎng)基，用接種針挑取大腸桿菌(-70 C甘油保存 菌)，在平板培養(yǎng)基上分級(jí)劃線，以能出現(xiàn)單菌落為宜；(2)將上述劃線的平板培養(yǎng)基倒置于恒溫培養(yǎng)箱中 37 C過夜培養(yǎng)。二、菌體培養(yǎng)(1)在劃

20、線平板培養(yǎng)基上挑取單菌落，接菌至1 ml LB培養(yǎng)基中，37 C搖菌過夜。(2)取0.5-1ml過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到100 ml LB中，37 C (180 rpm) 震蕩培養(yǎng)，直至OD600達(dá)至口0.40.5 (約培養(yǎng)4小時(shí))，放置冰上停(3)將培養(yǎng)菌體轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中，4 C 4,000 rpm/min離心5 min; 同時(shí)配置CaCl2溶液。(4)棄上清，取10 ml過濾除菌的0.1 mol/L CaC溶液重懸菌體沉淀， 冰浴 10-15 min, 4 C 4,000 rpm/min 離心5 min。(5)棄上清，沉淀重懸于10 ml過濾除菌的0.1 mol/L CaCl2 -

21、15 %甘 油(v/v)溶液，冰浴 10min, 4 C 4,000 rpm/min 離心5 min。(6)棄上清，加入2 ml過濾除菌的0.1 mol/L CaCl2 T5 %甘油(v/v)溶 液重懸菌體。(7)以每管100 w的量將菌液分裝于1.5 ml E瞳中，液氮冷凍后-80 C 凍存。注意事項(xiàng)(1)制備感受態(tài)所用的離心管、槍頭、細(xì)菌過濾器、EP管等均需實(shí)驗(yàn)前滅菌處理；整 個(gè)制備過程均需在冰浴條件下進(jìn)行；離 心前離心機(jī)應(yīng)事先預(yù)冷；重 懸菌體時(shí)不可太劇烈，以免影響感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率；農(nóng) 桿菌的感受態(tài)制備與上述過程大致相同，但培養(yǎng)條件應(yīng)控制在28 C,且培養(yǎng)基中應(yīng)加入Rif (利福平)以排除

22、雜菌干擾。三、轉(zhuǎn)化(熱激法)(1)取100區(qū)1感受態(tài)細(xì)胞于 冰浴上融化。(2)加入5 8區(qū)1純質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物，輕輕吹打混勻，冰浴10 min。將菌液放入42 C水浴中熱激70秒，立即放入冰浴中2 min。加入100區(qū)LB培養(yǎng)也，于37 C恒溫?fù)u床上200 rpm搖菌1小時(shí)。(5)將菌體均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的瓊脂平板表面，平板于 37 C倒 置培養(yǎng)過夜。注： 新倒的平板可于37培養(yǎng)箱中預(yù)先放置數(shù)小時(shí)至過夜干燥。當(dāng)轉(zhuǎn)化的是TA克隆連接產(chǎn)物時(shí)可在菌液中加入1000X24 mg/ml IPTG和 1000X20mg/ml X-gal (避光)以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。四、重組子的篩選和鑒定( 1) 取培養(yǎng)過

23、夜的平板，挑取單菌落(藍(lán)白斑篩選時(shí)挑白斑，同時(shí)可挑取12個(gè)藍(lán)斑做陰性對(duì)照)于1 ml LB 培養(yǎng)液中， 37 C 搖菌過夜；(2)每個(gè)樣本取0.5-1.0膜菌液為模板用PCR法鑒定，每管反應(yīng)體 系最低可減少至10PCR產(chǎn)物電泳，能得到所需條帶的樣本進(jìn)一步提取質(zhì)粒酶切鑒定或送樣品測(cè)序。9、質(zhì)粒DNA 的提取(堿裂解法)此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取。提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切 PCR 擴(kuò)增。(1)、取1 ml培養(yǎng)菌體于2 ml EP管中，12000 rpm離心3分鐘，棄 上清液，使細(xì)菌沉淀盡量干燥；(2)、將細(xì)菌沉淀重懸于用冰預(yù)冷的100瞪液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/

24、L EDTA pH 8.0 ， 25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0 )中，吸打 均勻；(3)、加入200 闞配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH ,終濃度1 % SDS (m/v),先力口 SDS,),蓋緊EP管口，來回輕輕顛倒離心管，以混合混合物，確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面與溶液II 接觸，不要渦旋，置于冰浴中；(打開蓋有絲狀物)(4)、加入150 項(xiàng)冷7液山(每100 ml的溶液III中含60 ml 5 mol/L乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml也。)，蓋緊EP管口，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液III 在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上 23分鐘；(5

25、)、12000g離心15 min,取上清液于另一新1.5 ml EP管(注意勿 吸入下層雜質(zhì))；(6)、加入等體積(約400 gl)的氯仿振蕩混勻，于室溫放置2分鐘， 12000 2離心3分鐘；(7)、取上清用兩倍體積的乙醇沉淀雙鏈 DNA,混合后-20 C放置30 分鐘以上，12000溝離心15分鐘；(8)、去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，再將附于管壁的液滴除盡；(9)、力口1 ml 70 %乙醇洗滌沉淀，混勻，12,000 g離心2分鐘，棄上清， 將開口的EP管置于室溫使乙醇揮發(fā)，直至EP管中內(nèi)沒有可見的液 體存在(510分鐘)，用適量的ddH2。(二級(jí)水)或Rnase

26、k溶 解；(10)、電泳或PCR鑒定。10、酶切( 1)酶切前需確定待切樣品的濃度，并選擇合適的限制性內(nèi)切酶和配套 Buffer 。(2)在PCR管中加入如下成分：ReagentQuantity, for 10 lof reaction mixture10Buffer1 0待切樣品8.5 l p酶0.5 l pTotal10 0/Sample(3)混勻樣品并短暫離心，將PCR管置于37 C中溫育3-4 hr,若待切樣品為PCR產(chǎn)物，則可將反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。(4)用未酶切的質(zhì)粒作為對(duì)照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。注：當(dāng)酶切樣品用于回收而不是鑒定時(shí)， 可按比例適當(dāng)加大反應(yīng)體積。雙酶切可 選用二者活T

27、t都較高的Buffer或者通用Buffer,但要注意不能有星號(hào)反應(yīng)。11、Ni柱純化His-tag蛋白質(zhì)非變性條件下抽提His-Tag蛋白質(zhì)下列方法適用于從細(xì)菌中抽提通常含有連續(xù)6個(gè)組氨酸尾(HisTag Protein)的具有天然結(jié)構(gòu)的可溶性重組蛋白質(zhì) (Native Protein)。 其他來源的蛋白質(zhì)樣品，如果目標(biāo)蛋白質(zhì)具有 His-Tag結(jié)構(gòu)，提供的 層析方法可供參考。一、樣品準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室用的pET載體表達(dá)系列，在細(xì)胞OD600=0.5-0.8時(shí),用1mM IPTG誘導(dǎo)1-6小時(shí)(也可做 時(shí)間進(jìn)程），可以獲得理想的表達(dá)效率。收集細(xì)胞，置于 -70 度或立即進(jìn)行步

28、驟 2 操作。加入 1/20 細(xì)胞生長(zhǎng)體積的 NTA-0 Buffer （ 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10 % Glycerol）和 PMSF。PMSF用無水乙醇配制 成200 mM儲(chǔ)存液，-20度或4度保存；PMSF使用的工作濃度位1 mM ; 注意： PMSF 見水分解，需要在使用前加入。該步驟冰上操作。將細(xì)胞懸浮起來，加入溶菌酶（工作濃度位0.2-0.4 mg/ml ，如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS 或 pLysE ，可以不加溶菌酶），混勻，冰上放置 30 分鐘，超聲破碎細(xì)胞（用超聲破碎儀破菌 6 次，每次 10 sec,間歇10 sec,電壓

29、200-300 V）。該步驟冰上操作。加入 10% Triton X-100, 使 Triton 的終濃度為0.05%， 充分混勻，冰上放置 15 分鐘，間或混勻）；冰上超聲破碎細(xì)胞，同時(shí)降低粘稠度。（5）加入1M MgCl2,使MgCl2的終濃度為1mM ,混勻。加入DNase, 使DNase的終濃度為10 mg/ml,混勻，室溫放置10分鐘。（6） 12000 g , 4度離心。（ 7）重組蛋白質(zhì)的可溶性鑒定12000溝，4C,離心20 min,取上清（為溶液 A）, 20 C保 存；另將沉淀用同樣裂解液1溶解（為溶液B）,同樣20 C保存， 供后繼分析使用。將上述 A、 B 溶液和誘導(dǎo)前

30、后的細(xì)菌進(jìn)行SDS電泳， 考馬斯亮藍(lán)染色， 比較分析重組蛋白質(zhì)的溶解性。 如果誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)位于 A 溶液中，則為可溶性蛋白；如果是在B 溶液中，則為非可溶蛋白。二、層析將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗。將樣品（步驟 2（6）加到NTA 層析柱中，流速控制在15 ml/小時(shí)左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。層析用 5 倍 NTA 體積的 NTA-0 Buffer 洗，流速控制在30 ml/小時(shí)左右。分別用 5 倍 NTA 體積的 NTA-20 ， NTA-40 ， NTA-60 ， NTA-80

31、， NTA-100, NTA-200, NTA-1000 Buffer 洗脫，流速控制在 15ml/小時(shí) 左右，收集洗脫液，每管收集一個(gè)NTA 體積。確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS/PAGE 分析。也可以用 BBST 的 Bradford 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的分布。目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。附溶液配方：NTA-0 Buffer:20 mM Tris-HCl pH 7.9, 0.5 M NaCl, 10 % Glycerol,NT

32、A-20 Buffer:20 mM Tris-HCl pH 7.9, 0.5 M NaCl, 10 % Glycerol, 20 mMImidazole（ 咪唑 ）NTA-40 Buffer:20 mM Tris-HCl pHImidazole（ 咪唑 ）NTA-60Buffer:20 mM Tris-HCl pHImidazole（ 咪唑 ）NTA-80Buffer:20 mM Tris-HCl pHImidazole（ 咪唑 ）NTA-100Buffer:20 mM Tris-HCl pHImidazole（ 咪唑 ）NTA-200Buffer:20 mM Tris-HCl pHImida

33、zole（ 咪唑 ）NTA-1000 Buffer:20m M Tris-HCl pHImidazole （咪唑 ）7.9, 0.5 M NaCl, 107.9, 0.5 M NaCl, 107.9, 0.5 M NaCl, 107.9, 0.5 M NaCl, 107.9, 0.5 M NaCl, 107.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol, 40 mM% Glycerol, 60 mM% Glycerol, 80 mM% Glycerol, 100 mM% Glycerol, 200 mM% Glycerol, 1000 mM11.2 變性條件下從包涵體中純化 His-

34、Tag 的蛋白質(zhì)有些蛋白質(zhì)細(xì)菌或其他細(xì)胞中表達(dá)效率很高， 但溶解性很差， 通常形成包涵體。 這些蛋白質(zhì)的溶解通常需要用鹽酸胍或尿素。 與 MBP和GST的親和層析材料相比，NTA樹脂可以在6 M的鹽酸月瓜存在的情況下與具有His Tag 的蛋白質(zhì)結(jié)合。整個(gè)層析過程都是在有鹽酸胍的條件下進(jìn)行。 純化后的蛋白質(zhì)需要進(jìn)行復(fù)性，正確復(fù)性的蛋白質(zhì)才具有生物學(xué)活性。下列方法（步驟4-5）用于從細(xì)菌中抽提含His-Tag 位于包涵體變性蛋白質(zhì)。一、樣品準(zhǔn)備（ 1） 準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室用的 pET 載體表達(dá)系列，在細(xì)胞OD600=0.5-0.8時(shí)，用1mM IPTG誘導(dǎo)1-3小時(shí)，可以獲得理

35、想的表達(dá)效率。收集細(xì)胞，置于 -70 度或立即進(jìn)行步驟 2 操作。（ 2）加入1/20 細(xì)胞生長(zhǎng)體積的 GuNTA-0 Buffer （ 20 mM Tris-HCl pH7.9,0.5 M NaCl ,10 % Glycerol, 6 M Guanidium HCl ）和 PMSF。PMSF用無水乙醇配制成200 mM 儲(chǔ)存液， -20 度或 4 度保存； PMSF 使用的工作濃度位1 mM;注意：PMSF見水分解，需要在使用前加入。將細(xì)胞懸浮起來，冰上超聲破碎細(xì)胞，降低粘稠度。室溫放置 30 分鐘，間或混勻或用磁力攪拌。12000第4度離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20度 保存

36、。二、層析1） 將 NTA 樹脂裝入合適的層析柱，層析用 10 倍 NTA 體積的GuNTA-0 Buffer 洗。將樣品（步驟 2（5）加到NTA 層析柱中，流速控制在15 ml/小時(shí)左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。層析用 5 倍 NTA 體積的 GuNTA-0 Buffer 洗，流速控制在30 ml/小時(shí)左右。分別用 5 倍 NTA 體積 GuNTA-20 ， GuNTA-40 ， GuNTA-60 ， GuNTA-100, GuNTA-500洗脫，流速控制在15 ml/小時(shí)左右，收集洗脫液，每管收集一個(gè)NTA 體積。確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS/PAGE 分析。也可以用 BBST 的 Bradford 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的分布。目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。7） 純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)需要復(fù)性，復(fù)性常用的手段可以參考有關(guān)手冊(cè)確定的原則，根據(jù)蛋白質(zhì)的特性來摸索具體的方案