生物化學(xué)-03 蛋白質(zhì)化學(xué)

1、第三章 蛋白質(zhì)化學(xué) 主要內(nèi)容：介紹蛋白質(zhì)的構(gòu)件單位氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類、性質(zhì)及肽的概念，重點(diǎn)討論蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)和功能的相互關(guān)系。思考目錄第一節(jié) 蛋白質(zhì)通論.第二節(jié) 蛋白質(zhì)的基本構(gòu)件單位氨基酸.第三節(jié) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)和肽.第四節(jié) 蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu).第五節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系.第六節(jié) 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì).思考第一節(jié) 蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)的元素組成.與分類.二、蛋白質(zhì)的大小和分子量.三、蛋白質(zhì)的構(gòu)象及結(jié)構(gòu)的組織層次.四、蛋白質(zhì)功能的多樣性.主要組成元素： C(50-55%)、H(5-7%) 、O(20-24)、N(15-17%)、S(0-5%)。微量的元素： P、Fe、Cu、Zn、M

2、o、I、Se 等。 一、蛋白質(zhì)的元素組成.與分類.大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量較恒定，平均含N量為16。 即1g氮相當(dāng)于6.25g蛋白質(zhì)，6.25稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。這是凱氏定氮法測蛋白質(zhì)含量的理論依據(jù)：樣品中蛋白質(zhì)含量樣品中的蛋白質(zhì)含N量6.25蛋白質(zhì)(Protein)是由不同氨基酸按照一定順序，肽鍵連接而成的一條或多條肽鏈構(gòu)成的生物大分子。蛋白質(zhì)的分子組成蛋白質(zhì) 月示 胨 多肽 二肽 氨基酸 104 5103 2103 1035102 2102d 102蛋白質(zhì)的其他組分簡單蛋白質(zhì) 結(jié)合蛋白質(zhì) 氨基酸部分 非氨基酸部分 糖 脂 核酸 輔因子 蛋白質(zhì)的分類根據(jù)分子形狀分類球狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì).根

3、據(jù)組成分類簡單蛋白質(zhì).活性蛋白質(zhì)（如酶蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、運(yùn)動蛋白、 保護(hù)和防御蛋白、受體蛋白.）根據(jù)功能分類非活性蛋白質(zhì)（如硬蛋白、角蛋白）(1)簡單蛋白質(zhì)分類結(jié)合蛋白質(zhì)（Conjugated proteins)分類：單純蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)結(jié)合而成，如：（3）衍生蛋白質(zhì) (Derived proteins)： 經(jīng)化學(xué)或酶促作用而得到的蛋白質(zhì)改性物。如：經(jīng)凝乳酶凝結(jié)的酪蛋白，及胨，肽等降解產(chǎn)物。二、蛋白質(zhì)的大小和分子量蛋白質(zhì)是由氨基酸以肽鍵首尾相連而成的共價多肽鏈, 其分子量變化范圍大約在6000-1000，000道爾頓之間。如表1-1蛋白質(zhì) 亞基數(shù)目 分子量胰島素 1 5 733細(xì)胞色素C 1 1

4、2 398溶菌酶 1 14 300-淀粉酶 2 97 600血紅蛋白 4 64 500脲酶 6 483 000醇脫氫酶 4 150 000谷氨酰胺合成酶 12 600 000谷氨酸脫氫酶 40 1 000 000煙草花葉病毒蛋白 2130 40 000 000三.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要層次一級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)primary structuresecondary structureTertiary structurequariernary structure超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域 supersecondary structureStructure domain -折疊片 -螺旋體 松散肽段亞基三

5、級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象示意圖四、蛋白質(zhì)的主要生理功能 蛋白質(zhì)（protein）是生活細(xì)胞內(nèi)含量最豐富、功能最復(fù)雜的生物大分子，并參與了幾乎所有的生命活動和生命過程。因此，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能始終是生命科學(xué)最基本的命題。 生物體最主要的特征是生命活動，而蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者，具有以下主要功能：催化功能；結(jié)構(gòu)功能；調(diào)節(jié)功能；防御功能；運(yùn)動功能；運(yùn)輸功能；信息功能；儲藏功能 第二節(jié) 蛋白質(zhì)的基本構(gòu)件單位氨基酸一、常見的蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)通式.二、20種常見的蛋白質(zhì)氨基酸分類及結(jié)構(gòu).三、不常見的蛋白質(zhì)氨基酸和非蛋白質(zhì)氨基酸.四、氨基酸的性質(zhì).一、常見的蛋白質(zhì)-氨基酸的結(jié)構(gòu)通式.氨基酸的結(jié)

6、構(gòu)生物體內(nèi)的氨基酸類別蛋白質(zhì)氨基酸： 蛋白質(zhì)中常見的20種氨基酸稀有的蛋白質(zhì)氨基酸：蛋白質(zhì)組成中，除上述20種常見氨基酸外，從少數(shù)蛋白質(zhì)中還分離出一些稀有氨基酸，它們都是相應(yīng)常見氨基酸的衍生物。如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等。非蛋白質(zhì)氨基酸：生物體內(nèi)呈游離或結(jié)合態(tài)氨基酸。20種常見蛋白質(zhì)氨基酸的分類、結(jié)構(gòu)及三字符號據(jù)營養(yǎng)學(xué)分類 必需非必需據(jù)R基團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類 脂肪族A. （中性、含羥基或巰基、酸性、堿性）芳香族A(Phe、Tyr、Trp).雜環(huán)(His、Pro).據(jù)R基團(tuán)極性分類極性R基團(tuán)AA.非極性R基團(tuán)AA（種）.不帶電荷（種）據(jù)氨基、羧基數(shù)分類一氨基一羧基一氨基二羧基(Glu、Asp)

7、20種氨基酸的結(jié)構(gòu)二氨基一羧基(Lys、His、Arg)人的必需氨基酸LysTrpPheValMetLeuIleThrArg、His帶電荷：正電荷（種）負(fù)電荷（種）二、20種常見的蛋白質(zhì)氨基酸分類及結(jié)構(gòu).甘氨酸 （Gly,G）丙氨酸 （Ala,A）纈氨酸 （Val,V）亮氨酸 （Leu,L）異亮氨酸 （Ile,I）中性脂肪族氨基酸 含羥基或硫脂肪族氨基酸絲氨酸 （Ser,S）蘇氨酸 （Thr,T）半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸 （Met,M）酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸 （Glu,E）天冬酰胺 （Asn,N）谷氨酰胺 （Gln,Q）堿性氨基酸賴氨酸 （Lys,K）精氨酸 （

8、Arg,R）組氨酸 （His,H）雜 環(huán)氨基酸雜環(huán)氨基酸組氨酸 （His,H）脯氨酸 （Pro,P）芳香族氨基酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸 （Trp,W）三、不常見的蛋白質(zhì)氨基酸和非蛋白質(zhì)氨基酸.不常見的蛋白質(zhì)氨基酸非蛋白質(zhì)氨基酸.四、氨基酸的性質(zhì)(1)AA的兩性電離和等電點(diǎn). (2)光學(xué)活性和光譜性質(zhì). (3)重要化學(xué)反應(yīng)：（1)氨基酸的兩性解離及等電點(diǎn)（pI）: 氨基酸是弱兩性電解質(zhì)pH = pI 凈電荷=0 pH pI凈電荷為負(fù)CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3+ + H+ OH- + H+ OH-(pK1)(pK2) 當(dāng)氨基酸溶液在某一

9、定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(diǎn)(isoelectric point)。甘氨酸滴定曲線甘氨酸鹽酸鹽（A+）等電點(diǎn)甘氨酸（A）甘氨酸鈉（A-）一氨基一羧基AA的等電點(diǎn)計算：pI=2pK1+pK2谷氨酸（A）和賴氨酸（B）滴定曲線和等電點(diǎn)計算一氨基二羧基AA的等電點(diǎn)計算：pI=2pK1+pKR二氨基一羧基AA的等電點(diǎn)計算：pI=2pK2+pKRBApK1pK2pIpIpK3pK3pK2pK1加入的OH-mL數(shù)加入的OH-mL數(shù)pHpH His的咪唑基的pKa值是最接近生理pH值的一種（游離氨基酸中

10、為6.00，在多肽鏈中為7.35 ） ，是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。(2)光學(xué)活性和光譜性質(zhì).1、旋光性：除甘氨酸外，其它天然-氨基酸都有不對稱碳原子，其它天然氨基酸都有旋光性，均屬于L-型。2、紫外吸收光譜： 芳香族氨基酸色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基團(tuán)中含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光區(qū)顯示特征的吸收譜帶，最大光吸收（max）分別為280、275、和257nm。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)都含有這些氨基酸殘基，因此，紫外分光光度法可測定蛋白質(zhì)含量。TryTyrPhe的 紫外吸收光譜摩爾吸收系數(shù)波長(3)重要化學(xué)反應(yīng)：與2,4一二硝基氟苯(DNFB)反應(yīng)（sa

11、nger反應(yīng)）: 用于蛋白質(zhì)N-端測定.與苯異硫氰酯（PITC）的反應(yīng)（Edman反應(yīng)）： 用于蛋白N-端測定，蛋白質(zhì)順序測定儀設(shè)計的依據(jù)。 與茚三酮反應(yīng):用于氨基酸定量定性測定 成肽反應(yīng)：氨基酸合成肽的反應(yīng)基礎(chǔ)1、與2,4-二硝基氟苯(DNFB)反應(yīng) 2,4-二硝基氟苯(DNFB)在弱堿溶液中與AA反應(yīng)生成2,4-二硝基苯基氨基酸,英國的Sanger用這個反應(yīng)鑒定多肽N-末端的氨基酸,用以測定多肽或蛋白質(zhì)的AA排序。現(xiàn)在根據(jù)此原理設(shè)計出了”蛋白質(zhì)序列測定儀”2、Edman反應(yīng) 與異硫氰酸苯酯（PITC）在弱堿條件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰（PTC)衍生物,與酸發(fā)生環(huán)化生成PTH-aa,這是著名

12、的Edman降解,進(jìn)行多肽鏈N-末端氨基酸測定。苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物3、茚三酮反應(yīng)（-NH2和-COOH共同參加的反應(yīng)） 茚三酮在弱酸性溶液中與-氨基酸共熱，生成藍(lán)紫色物質(zhì),脯氨酸或羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物。4.氨基酸的成肽反應(yīng)第三節(jié) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)和肽.一、蛋白質(zhì)中氨基酸的連接方式和一級結(jié)構(gòu).二、肽鍵的結(jié)構(gòu)和性質(zhì).三、肽的物理和化學(xué)性質(zhì)四、天然存在的活性肽五、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定 六、蛋白質(zhì)的水解. 1 一級結(jié)構(gòu)概念 ： 一級結(jié)構(gòu)：指蛋白質(zhì)肽鏈中氨基酸的排列順序和連接方式。 共價結(jié)構(gòu)（化學(xué)結(jié)構(gòu)）：肽鏈的數(shù)目，AA的序列和二硫鍵的位置。2. 肽和肽鏈的結(jié)構(gòu)和命名 肽：由一AA的羧基和另

13、一AA的氨基脫水縮合而成的化 合物。肽鍵：AA之間脫水后形成的共價鍵，又稱酰胺鍵。一、蛋白質(zhì)中氨基酸的連接方式和一級結(jié)構(gòu). 肽的命名是根據(jù)氨基酸殘基的數(shù)目決定的： 寡肽：10個以下AA殘基組成的肽。 多肽：超過10個AA殘基組成的肽。 多肽鏈：由多個AA以肽鍵連接的一條鏈。 酰胺平面或稱（肽平面）：由CO和NH構(gòu)成肽鍵的四個原子和與之相連的兩個-碳原子構(gòu)成的剛性平面。 AA殘基：指的是肽鏈中的AA單位，不是完整的AA分子。維持一級結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵：共價鍵，主要為肽鍵。例：牛胰島素的一級結(jié)構(gòu) 一級結(jié)構(gòu)的書寫方式： 從N末端到C末端，用氨基酸的三字符號或單符號連續(xù)排列。若用三字符，每個氨基酸之間用圓點(diǎn)

14、隔開，單字符表示不用圓點(diǎn)。如三字符表示為Ala.Val.Gly.Thr.Met.Phe.Cys.Ser.Lys等。單字符表示為：AVGTMFCSK。 二、肽鍵的結(jié)構(gòu)和性質(zhì).肽單位：多肽中，每個酰胺平面即是一個肽單位。它是研究蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的最小單位。肽基的C、O和N原子間的共振相互作用共振產(chǎn)生的重要結(jié)果：限制繞肽鍵的自由旋轉(zhuǎn) 形成酰胺平面 產(chǎn)生鍵的平均化 肽鍵呈反式構(gòu)型sp2sp2sp2sp3共振雜化體肽鍵的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(1)肽鍵(C-N鍵)，鍵長1.32,比一般的C-N單鍵(1.49)短，但比一般的C=N雙鍵(1.27)長，具有部分雙鍵的性質(zhì)，不能沿C-N鍵自由旋轉(zhuǎn)。(2)羧基氧原子與NH2基

15、氫原子彼此處于N-C兩側(cè)，形成反式結(jié)構(gòu)。(3)與N-C鍵相連的N-Ca和C-Ca可以旋轉(zhuǎn)，其旋轉(zhuǎn)角度分別為和，和稱兩面角(構(gòu)象角)，用于描述多肽的所有可能構(gòu)象。(4)肽鍵中四個原子和它相鄰的兩個Ca處于同一平面，形成酰胺平面。 1.在晶體或溶液中以兩性離子狀態(tài)存在。2.熔點(diǎn)高。3.其酸堿性決定于N端氨基、C端羧基和側(cè)鏈R基。4.雙縮脲反應(yīng)。5.與氨基酸類似的反應(yīng)： DNFB DNS PITC 反應(yīng)等。三、肽的物理和化學(xué)性質(zhì) 類別：激素、抗菌素、輔助因子 實(shí)例：谷胱甘肽(glutathione)。 四、天然存在的活性肽 谷胱甘肽（GSH）- 谷胱甘肽在體內(nèi)參與氧化還原過程，作為某些氧化還原酶的輔

16、因子，或保護(hù)巰基酶，或防止過氧化物積累。GSSG將肽段順序進(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序 將肽段分離并測出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y定二硫鍵拆開純蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列測定的基本方法路線五、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定基本策略： 片段重疊法氨基酸順序直測法 基本步驟： (1) 測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目； (2)拆分蛋白質(zhì)的多肽鏈，斷開多肽鏈內(nèi)二硫鍵； (3)分析每一條多肽鏈的氨基酸組成； (4)鑒定多肽鏈N末端、C末端氨基酸殘基； (5)裂解多肽鏈成較小的片段； (6)測定各肽段的氨基酸順序； (7)片段重疊法重建完整多肽鏈一級結(jié)構(gòu)； (8)確定半胱氨酸殘基間形成二硫鍵交聯(lián)橋的位置。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定胰島素 -巰

17、基乙醇碘乙酸二硫鍵的斷裂多肽N、C-末端氨基酸的測定N端 Sanger法（二硝基氟苯反應(yīng)） DNS法（丹磺酰氯反應(yīng)） Edman法（苯異硫氰酸脂反應(yīng)） 氨肽酶法 C端 肼解法 還原法 羧肽酶法片段重疊法確定肽段在多肽鏈中順序示意圖所得資料： 氨基末端殘基 H 羧基末端殘基 S 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO借助重疊肽確定肽段次序示意圖：末端殘基 H S末端肽段 HOWT APS第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推斷全順序 HOWTOUSEO VERLAPS對角線電泳示意圖帶有二硫鍵的肽段偏離對角線而決定二硫鍵的位置。六、蛋白質(zhì)的水解根據(jù)水解程度分: 完全水解 氨基酸混合物