鋅指蛋白在各個(gè)組織中表達(dá)量的測(cè)定

1、印記基因的鑒定及功能分析-鋅指蛋白在各個(gè)組織中表達(dá)量的測(cè)定生物技術(shù)孫業(yè)潤(rùn)（1092810108）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模鹤哌M(jìn)實(shí)驗(yàn)室了解基本實(shí)驗(yàn)儀器，練習(xí)對(duì)各種儀器的使用；學(xué)習(xí)PCR原理，掌握PCR操作；通過(guò)電泳對(duì)DNA進(jìn)行分析；探究鋅指蛋白在不同組織中的表達(dá)量對(duì)比。實(shí)驗(yàn)原理：1,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR）又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火（復(fù)性）-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94C左右一定時(shí)間后，使模板DN

2、A雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至4060C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于72C左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。2，NDA凝膠電泳：NDA凝膠電

3、泳是常用的用于分離鑒定DNA,RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂糖作為支持物，利用DBA分子在涌動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電勢(shì)點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的移動(dòng)速度與其相對(duì)分子質(zhì)量成反比，當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）染色，在紫外燈光下可以檢測(cè)出DNA條帶，從而確定DNA片段在凝膠中的位置。與通過(guò)marker比較可進(jìn)行更加深入的研究3，通過(guò)比較不同組織cDNA中鋅指蛋白基因PCR后DNA帶的亮度來(lái)確定表達(dá)量的多少，但是

4、DNA多也可能是因?yàn)槟０逯锌赡艽嬖谥貜?fù)的編碼序列即基因的初始濃度高，所以要通過(guò)內(nèi)參基因（在不同組織中表達(dá)穩(wěn)定的基因）來(lái)確定待測(cè)基因的初始濃度。4,鋅指基序（zincfingermotif）。許多轉(zhuǎn)錄因子中都含有鋅指基序。這些蛋白通常含有多個(gè)指狀結(jié)構(gòu)可以插入靶DNA序列的大溝中。許多鋅指蛋白的比較表明，基序?yàn)槎喾N氨基酸序列提供了各種識(shí)別DNA序列結(jié)構(gòu)的框架。實(shí)驗(yàn)材料及儀器:DNA凝膠電泳：材料：瓊脂糖，電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），儀器：微波爐，電泳槽PCR:材料：dNTP，腦舌心肝肺胎盤(pán)的cDNA鋅指蛋白引物，內(nèi)參基因引物，酶，水，鎂離子儀器：PCR儀，PCR管其他儀器：微量移液器，簡(jiǎn)要離心機(jī)

5、，漩渦混合儀等些實(shí)驗(yàn)儀器的使用方法:1微量移液器，可以準(zhǔn)確吸取少量的液體。一個(gè)完整的移液過(guò)程包括：1）容量設(shè)定2）安裝移液頭3）吸液先將移液器排放按鈕按至第一停點(diǎn)，再將吸液頭垂直浸入液面。盡量避免吸液頭浸入液面過(guò)深，以免液壓對(duì)吸液的精確度造成影響。同時(shí)可以避免在吸取粘稠液體時(shí)在吸液頭表面粘上液體影響吸取精度。松開(kāi)移液器排放按鈕要平穩(wěn)，切記不能過(guò)快，以免導(dǎo)致液體吸入移液器內(nèi)部。4）排液排液時(shí)，吸液頭緊貼容器壁，先將排放按鈕按至第一停點(diǎn)，略作停頓以后,再按至第二停點(diǎn)，這樣做可以確保吸液頭內(nèi)無(wú)殘留液體。5）卸去移液頭一般用力下按吸液頭推出器即可卸掉吸液頭。6）如不使用，將移液器調(diào)到最大量程。2簡(jiǎn)要離

6、心機(jī)，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)要離心，粘在容器壁上的液體會(huì)被離心到底部，方便吸取3漩渦混合儀，混合，混勻液體。微量移液器（也稱(chēng)槍?zhuān)?shí)驗(yàn)步驟：1配置lOmlPCR體系按如下反應(yīng)體系逐步加入各反應(yīng)試劑:ComponentsVolumeFinalConcentrationddH2Otofinalvolume10ylNotapplicable10 xEasyTaqBuffer(含Mg2+)1yl1x25mMdNTPs0.8yl0.2mMForward+ReversePrimer(5yMeach)1yl0.2eachEasyTaqDNAPolymerase0.05yl2.5units1*cDNATemplate1ylas

7、required2使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增按以下程序設(shè)定PCR反應(yīng)程序：94C2-5min94C30sec50-60C30sec25-35cycles72Clmin/1-2kb72C5-10min16Cs3配置瓊脂糖凝膠1）用自來(lái)水或蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，將制膠板放入膠槽中;2）根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱(chēng)量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi)，定量加入電泳緩沖液；3）放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴溴化乙錠（EB）熒光染料,輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入膠槽中，小心去除其中氣泡，然后插上梳子待其凝固；4）室溫下3045分鐘后凝膠完全凝

8、結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；5）向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒(méi)過(guò)膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去。4對(duì)DNA進(jìn)行電泳在DNA樣品中加入10 x體積的載樣緩沖液（loadingbuffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒(méi)的凝膠加樣孔內(nèi)；接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)（靠近加樣孔的一端為負(fù)）。一般60100V電壓，電泳2040min即可；根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置，判斷是否終止電泳；電泳完畢，關(guān)上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。5熒光下觀察拍照Loadingbuffer是藍(lán)

9、色的，在凝膠上出現(xiàn)的藍(lán)色的帶是Loadingbuffer的位置而不是DNA的位置，對(duì)DNA的觀察需要在紫外燈下，配置凝膠時(shí)所加入的溴化乙錠EB含有一個(gè)可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)。用標(biāo)準(zhǔn)302nm紫外光透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號(hào)，可用Polaroid底片或帶CCD成像頭的凝膠成像處理系統(tǒng)拍攝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：DNA凝膠電泳結(jié)果分別為：腦，舌，心，肺，肝，腎，胎盤(pán)的鋅指蛋白基因和內(nèi)參基因。分析討論：一電泳結(jié)果的分析：首先左側(cè)的帶幾乎都出現(xiàn)在同一個(gè)位置，這個(gè)位置表示的就應(yīng)該是目的基因接下來(lái)比較目的基因?qū)?yīng)的內(nèi)參基因的亮度比如腦和舌組織中的內(nèi)參基因相同也就是說(shuō)對(duì)應(yīng)的目的基因的基數(shù)大致相同

10、，那么就可以判斷出在舌組織中鋅指蛋白的表達(dá)量大于腦組織；肝組織和胎盤(pán)組織的鋅指蛋白表達(dá)量幾乎都很少?gòu)淖髠?cè)看大致是肝大于胎盤(pán)，但是通過(guò)比較內(nèi)參基因發(fā)現(xiàn)肝的內(nèi)參少于胎盤(pán)的，那么總的來(lái)說(shuō)鋅指蛋白在肝中的表達(dá)量一定大于胎盤(pán)，以此類(lèi)推可以對(duì)各個(gè)組織中的表達(dá)量進(jìn)行比較。心臟組織的內(nèi)參基因可能因?yàn)椴僮鞑划?dāng)沒(méi)有出現(xiàn)條帶，應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)。通過(guò)SNP位點(diǎn)使用酶切法對(duì)印記基因的印跡性進(jìn)行探究原理：1,印記基因簡(jiǎn)單來(lái)講就是基因通過(guò)甲基化.組蛋白的乙?；确绞?，調(diào)控基因的表達(dá)使基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，而且這種基因表達(dá)沉默的發(fā)生取決于這個(gè)基因來(lái)自母本還是父本，其中父本不表達(dá)成為父本印記，相反母本不表達(dá)稱(chēng)為母本印記。2，單核苷酸多態(tài)性（SNP）因?yàn)槟硢蝹€(gè)堿基的改變?cè)斐蒁NA序列的差異，是造成個(gè)體差異的主要原因。3，限制性?xún)?nèi)切酶，識(shí)別特定的NDA序列，在特定位點(diǎn)解開(kāi)磷酸二脂鍵使DNA被切開(kāi)成為兩條鏈，形成粘性末端或平末端。4,將待測(cè)基因（一定是cDNA）進(jìn)行PCR然后進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)恰選為母本和父本有差異的SNP位點(diǎn)（假設(shè)父本可以被切開(kāi)，母本沒(méi)有該酶可以切開(kāi)的序列）那么在酶切之后對(duì)DNA進(jìn)行凝膠電泳預(yù)測(cè)的結(jié)果如下：假如此基因不是印記基因，那么cDNA中會(huì)存在兩條鏈即父本母本都表達(dá)，經(jīng)過(guò)酶切之后形成沒(méi)