6.電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

1、電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系李艷茹E-mail: liyr 電鏡技術(shù) 利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，在電鏡下對(duì)組織細(xì)胞中的某種成分進(jìn)行鑒定和定位的方法。多采用標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)未知的抗原。概 念1959年 鐵蛋白標(biāo)記抗體1968年 免疫酶標(biāo)記抗體1971年 免疫膠體金標(biāo)記抗體 23具有特異性抗體和高親合力的標(biāo)記物細(xì)胞和組織具有一定的通透性，能夠使抗體 和標(biāo)記物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)樣品中要有足夠的抗原物質(zhì)存在能夠較好地保持細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)基本要求4免疫電鏡技術(shù)樣品制備特點(diǎn)一、取材與固定1. 取材： 要求組織新鮮，最理想的方法是灌流固定取材。2. 固定劑與緩沖液的選擇固定劑：既能保持良好的細(xì)胞超

2、微結(jié)構(gòu)，又能保持組織細(xì)胞抗原性。緩沖液：多選用二甲砷酸鈉緩沖液配制固定劑和漂洗。pH值68之間。它可較快地使細(xì)胞呼吸停止，較早地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并具有減緩pH值下降的作用。 5 1.多聚甲醛戊二醛（Paraformaldelyde-glutaralodehyde，PG) 多聚甲醛常用濃度為；戊二醛常用濃度為0.010.05或0.1。因戊二醛對(duì)細(xì)胞抗原活性有一定的影響，故多采用較低的濃度。固定時(shí)間為15min1h。多聚甲醛穿透速度快，對(duì)酶及抗原活性影響小。該液經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，固定效果好，較常用。常用的固定劑6 2.過(guò)碘酸賴氨酸多聚甲醛 (Periodete-lysine- paraformaldelyd

3、e,PLP) 常用于檢測(cè)對(duì)戊二醛敏感的抗原和固定富含糖類的組織。 3.苦味酸多聚甲醛戊二醛 （Paraformaldelyde-glutaralodehyde,PAPG) 苦味酸穿透速度較快，可改善對(duì)細(xì)胞膜與胞質(zhì)的保存。常用的固定劑71免疫染色的方式 免疫染色是免疫電鏡技術(shù)的關(guān)鍵步驟。染色時(shí)機(jī)的選擇與標(biāo)本的包埋有關(guān)，電鏡的免疫染色分為三種方式： 包埋前染色 包埋后染色 冰凍超薄切片染色二、免疫染色8 又稱包埋前標(biāo)記法，標(biāo)本經(jīng)前固定后，在厚切片上先進(jìn)行免疫染色，然后取免疫反應(yīng)的陽(yáng)性部位，再經(jīng)鋨酸后固定、脫水、包埋、半薄切片、超薄切片及電子染色的樣品制備方法。多用于抗原含量少及對(duì)脫水包埋過(guò)程敏感的

4、抗原的檢測(cè)。包埋前染色9優(yōu)點(diǎn)：免疫染色時(shí)標(biāo)本未經(jīng)鋨酸固定，脫水及包埋過(guò)程，故抗原性保存好，免疫反應(yīng)充分在免疫反應(yīng)的陽(yáng)性部位做半薄切片定位，可提高檢出率包埋前染色后可選用高溫聚合的環(huán)氧樹(shù)脂作為包埋劑 包埋前染色10缺點(diǎn)： 因醛類固定液可使蛋白質(zhì)交聯(lián)，大分子抗體及標(biāo)記物難于穿透組織細(xì)胞。解決方法： 1. 盡量選用分子量小的抗體 2. 減薄組織的厚度利于滲透 （1）用振蕩切片機(jī)切3050m的厚切片 （2）用冰凍切片機(jī)將組織切成35m的薄片，免疫染 色后用倒扣包埋法包埋 3. 增加抗血清（特異性抗體）的孵育時(shí)間，可達(dá)24h包埋前染色114. 采用去垢劑處理組織 （1）用含0.01%皂角素的PG，58

5、min。皂角素為糖類化合物，可與膽固醇結(jié)合使膜上形成孔道。因其對(duì)膜結(jié)構(gòu)的影響較小，故用于大多數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究。 （2）用0.02%0.04%TritonX-100進(jìn)行處理。TritonX-100是非離子去垢劑，能除去脂質(zhì)，多用于細(xì)胞骨架的研究。5. 采用凍融法包埋前染色12 又稱包埋后標(biāo)記法，將已固定和包埋的標(biāo)本制成超薄切片后，再進(jìn)行免疫染色的方法，也稱為載網(wǎng)染色?？捎糜诩?xì)胞表面、細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)抗原的檢測(cè)。包埋后染色13優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保存較好陽(yáng)性結(jié)果有高度的可重復(fù)性一張切片可進(jìn)行多重免疫染色同一批切片可進(jìn)行不同目的的觀察包埋后染色14缺點(diǎn)：標(biāo)本經(jīng)過(guò)電鏡樣品制備后染色，可使抗原活性減弱如選

6、用環(huán)氧樹(shù)脂進(jìn)行包埋后染色，該切片的免疫反應(yīng)不易進(jìn)行，需用10%過(guò)氧化氫蝕刻10min，以去除鋨酸和增強(qiáng)樹(shù)脂的通透性，包埋后染色目前常采用低溫包埋技術(shù)因銅網(wǎng)易與化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，故需選用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)載網(wǎng)染色時(shí)要在濕盒內(nèi)進(jìn)行，并注意保持網(wǎng)面的濕潤(rùn)包埋后染色15 環(huán)氧樹(shù)脂 丙稀酸酯(acrylic resin)：具有低黏度、親合性強(qiáng)和優(yōu)良的切 割性能，并耐受電子束的轟擊及在低溫下聚合的特點(diǎn)。 Lowicryl K4M：為低溫水溶性包埋劑，較常用。特點(diǎn)是低溫下（-35）可保持低粘度；在紫外光（波長(zhǎng)360nm）下可聚合；聚合后可在常溫下切片；能較好地保存組織結(jié)構(gòu)和抗原性位，減少背景非特異性染色，故多用于免

7、疫細(xì)胞化學(xué)的包埋后染色。LR white ：為混合的丙稀酸單體，對(duì)脂類溶解度低，保存膜結(jié)構(gòu)較好，可耐受電子束轟擊，因而可不做支持膜。熱聚合60 ，24 h；冷聚合-25 ，加速劑協(xié)助聚合。常用的包埋劑16指組織塊經(jīng)過(guò)短時(shí)間固定后，浸入2.3mol/L 的蔗糖溶液中，以液氮速凍后，在冰凍超薄切片機(jī)上切片，再經(jīng)蔗糖和PBS凍融和漂洗，進(jìn)行免疫染色。該方法較靈敏，抗原性及微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好且操作時(shí)間短。 冰凍超薄切片染色17 目的： 排除非特異性染色 確定染色方法的特異性 確定操作技術(shù)的可信性 對(duì)照實(shí)驗(yàn)： 1.陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)： 用已知存在某種相應(yīng)抗原的組織切片與待檢切片同時(shí)染色。已知抗原的組織切片作為對(duì)照，其

8、結(jié)果為陽(yáng)性。免疫染色的對(duì)照實(shí)驗(yàn)182.陰性實(shí)驗(yàn)：包括下列實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果均為陰性?？瞻讓?duì)照：用PBS代替一抗替代實(shí)驗(yàn)：用制備一抗相同種屬動(dòng)物的正常血清或無(wú)關(guān) 的特異性抗體替代一抗吸收實(shí)驗(yàn)：用相應(yīng)已知抗原與一抗混合，使之沉淀，再用上清液孵育標(biāo)本阻斷實(shí)驗(yàn)：先用未標(biāo)記的特異性抗體孵育標(biāo)本與抗原結(jié)合，再用已標(biāo)記的同種抗體進(jìn)行染色免疫染色的對(duì)照實(shí)驗(yàn)191.增強(qiáng)特異性染色：蛋白酶消化法、抗原修復(fù)法、選擇合適的抗體稀釋度及合適的孵育時(shí)間等。2.減少非特異性染色：內(nèi)源性過(guò)氧化物酶可用3%H2O2， 20-30min。內(nèi)源性生物素采取飽和處理的方法，用親合素 25g/ml ，15min。靜電吸引所致的吸附作用可用與

9、二抗同種動(dòng)物的非免疫血清（用5-10%PBS稀釋）或用2-5%牛血清白蛋白（BSA）封閉。免疫染色的注意事項(xiàng)203.一抗的選用、稀釋度及孵育時(shí)間4.二抗的選用和稀釋度5.顯色劑的選擇6.顯色時(shí)間7.緩沖液的選擇免疫染色的注意事項(xiàng)211.鐵蛋白（ferritin） 鐵蛋白是直徑為12-14nm的球形蛋白，鐵芯直徑為5.5-7.0nm。由于鐵蛋白在樣品中不易分辨，并且正常組織內(nèi)也含有鐵蛋白，近年來(lái)膠體金的使用日益廣泛，所以現(xiàn)在鐵蛋白不常用。電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)中的標(biāo)記物22 2.辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP） 辣根過(guò)氧化物酶是由無(wú)色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉輔基結(jié)

10、合而成的糖蛋白，具有穩(wěn)定性強(qiáng)和反應(yīng)特異性高的優(yōu)點(diǎn)。其作用原理是HRP通過(guò)過(guò)氧化氫(H2O2)作為受氫體，以還原型3，3-二氨基聯(lián)苯胺體(DAB) 作為供氫體來(lái)催化氧化還原反應(yīng)。 HRP DAB-H2+H2O2 DAB+2H2O電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)中的標(biāo)記物233.膠體金 膠體金是氯金酸水溶液在還原劑作用下懸浮液。膠體金表面帶負(fù)電荷的疏水性顆粒，在水溶液中呈溶膠狀的紅葡萄酒色。它可與蛋白質(zhì)正電荷間靠靜電相互吸引，結(jié)合非常穩(wěn)定。金顆粒直徑5-150nm，電鏡常選用510nm的球形顆粒。由于金顆粒大小不同，可用于分別標(biāo)記不同的抗體，雙重標(biāo)記或多重標(biāo)記；而且可以計(jì)數(shù)顆粒進(jìn)行定量分析。電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)中的標(biāo)

11、記物24電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)中的標(biāo)記物25 酶標(biāo)免疫電鏡技術(shù)是以酶作為抗原抗體反應(yīng)的標(biāo)記物，在既不改變抗原抗體的免疫反應(yīng)特異性，也不影響酶活性的條件下，與相應(yīng)的酶底物作用形成具有較高電子密度終產(chǎn)物的技術(shù)。酶標(biāo)免疫電鏡技術(shù)26 免疫染色系統(tǒng)包括：識(shí)別系統(tǒng): 一抗（特異性抗體）聯(lián)結(jié)系統(tǒng): 二抗（聯(lián)結(jié)抗體）顯色系統(tǒng): 三抗（酶標(biāo)抗體）、顯色劑免疫染色的方法27（1）直接法（direct method） 用酶標(biāo)記的特異抗體直接與靶抗原結(jié)合，再與酶底物作用產(chǎn)生有色產(chǎn)物（顯色）。適用于表面抗原的定位。（2）間接法（indirect method） 將待測(cè)細(xì)胞或組織切片,先與未標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合,再用已標(biāo)記的

12、免疫蛋白作為二抗與一抗相結(jié)合。免疫染色的方法28（3）過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法 (peroxidase antiperoxidase method,PAP法) 先用特異性抗體（一抗）與靶抗原結(jié)合，再用二抗聯(lián)結(jié)抗體，最后三抗是PAP復(fù)合物（即以HRP為抗原，在與一抗同種動(dòng)物身上誘發(fā)的抗體，這種抗體與HRP結(jié)合成免疫復(fù)合物）免疫染色的方法29免疫染色的方法30 （4）親合素-生物素復(fù)合法 (avidin-biotin complex method, ABC法) 特異性抗體（一抗）與靶抗原結(jié)合，用生物素化抗體作為聯(lián)結(jié)抗體，最后三抗是ABC復(fù)合物（即親合素與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的生物素復(fù)合物）。免疫染色的方

13、法31免疫染色的方法32 (5)鏈酶親合素生物素復(fù)合法(streptavidin biotin complex method, SABC法) 鏈酶親合素是由鏈酶菌中提取的蛋白質(zhì) *特異性抗體（一抗）與靶抗原結(jié)合 *聯(lián)結(jié)抗體為生物素化抗體 *三抗為HRP標(biāo)記的鏈酶親合素免疫染色的方法331. 環(huán)氧樹(shù)脂包埋的超薄切片（經(jīng)1-10%H2O210min）或低溫包埋的超薄切片2. 2%NSS, 5min，吸干3. 特異性一抗，4,，24-48hr，PBS洗4. 2%NSS，5min，不吸干5. 羊抗兔球蛋白(1:50-1:100)10min， PBS洗6. 2%NSS ，5min，不吸干7. 兔PAP(

14、1:50-1:100)2-3min， PBS洗8. 加含H2O2的DAB, 3-4min9. Tris-HCl洗10. PBS洗11. 干燥后在透射電鏡下觀察PAP法包埋后染色34PAP法包埋后染色35 1. 觀察單個(gè)細(xì)胞表面抗原：采用各種方法均可，無(wú)需考慮穿透組織的問(wèn)題；多用ABC法或PAP法。 2. 觀察細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)抗原：進(jìn)行包埋前染色需使用穿透劑，選用分子量小的酶標(biāo)記物（鼠PAP法）。包埋后染色無(wú)需使用穿透劑，可選用兔PAP法或ABC法。酶標(biāo)記免疫電鏡注意事項(xiàng)3637 指利用膠體金在堿性環(huán)境下帶負(fù)電荷的性質(zhì)，使其與抗體相吸引將其標(biāo)記，然后與未知抗原結(jié)合，在電鏡下觀察膠體金存在的部位，從

15、而確定免疫反應(yīng)部位的方法。膠體金標(biāo)免疫電鏡技術(shù)38優(yōu)點(diǎn)：膠體金顆粒電子密度高，電鏡下清晰可辨。膠體金制備簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜；多不出現(xiàn)非特異性吸附和標(biāo)記；常用覆有火棉膠的鎳網(wǎng)進(jìn)行免疫染色。膠體金液體無(wú)毒，對(duì)人體無(wú)損傷，使用安全。膠體金標(biāo)記的抗體可加入培養(yǎng)液中對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行標(biāo)記定位。膠體金標(biāo)記的特異抗體、包埋后染色多用于細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)（因金顆粒對(duì)細(xì)胞膜的穿透性差）；包埋后染色用途較廣，多采用間接法?？捎糜诩?xì)胞表面、胞質(zhì)中細(xì)胞器及胞核中特異抗原和抗體的研究，也可用于細(xì)胞骨架的研究。膠體金標(biāo)免疫電鏡技術(shù)391. 鎳網(wǎng)的載網(wǎng)切片2. 1-2%BSA/1:5NSS 10min3. 特異性一抗 ，4

16、，20hr/室溫，2hr4. 0.05mol/L TBS 含0.5%TritonX-100洗，30min5. 0.02mol/LTBS含0.1%BSA洗，1min、6. 2%BSA /1:5NSS ，10min7. 膠體金標(biāo)記二抗，4過(guò)夜/室溫，2hr8. 0.02mol/LTBS洗，1min9. 0.05mol/LTBS含0.5%TritonX-100洗，30min；雙蒸水洗，3次10.鈾染色，4-5min；鉛染色，2min11.TEM觀察膠體金標(biāo)間接法包埋后染色膠體金標(biāo)免疫電鏡技術(shù)40抗體要有高度特異性和親合力被檢組織應(yīng)有較高濃度的抗原清洗液和器皿清潔度高清洗要徹底孵育要在濕盒內(nèi)進(jìn)行，保持

17、載網(wǎng)濕潤(rùn)金標(biāo)記物在保存中可產(chǎn)生凝集物，故在使用前應(yīng)稀釋后離心800010000rpm/min，2030min，以去除凝集物。膠體金標(biāo)記免疫染色的注意事項(xiàng)膠體金標(biāo)免疫電鏡技術(shù)41膠體金標(biāo)免疫電鏡技術(shù)4243 (C) secretory granules, which defines them as autolysosomes. The arrowheads show LAMP-2 labeling on the limiting membrane of the autolysosome, indicating that the secretory granule is enclosed within the autolysosome. (D) Another example of an autolysosome in Gnptab / pancreatic a