分子與基因工程實(shí)驗(yàn)七

1、分子與基因工程實(shí)驗(yàn)七第1頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一二、實(shí)驗(yàn)原理 農(nóng)桿菌重組子中攜帶經(jīng)改造的Ti 質(zhì)粒（含有幫助T-DNA跳到植物染色體上的Vir 區(qū)）和包含T-DNA的雙元載體pBinGUS，質(zhì)粒pBinGUS上T-DNA上插入了報(bào)告基因（GUS）和卡那霉素篩選標(biāo)記基因NPTII。 葉盤法轉(zhuǎn)化是通過(guò)人為在煙草葉片上產(chǎn)生傷口，侵染時(shí)農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬軅箅p子葉植物分泌的酚類化合物透過(guò)農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜，活化vir區(qū)基因，vir區(qū)基因的活化，促使T-DNA進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)移。T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后整合到核DNA上。共培養(yǎng)可使T-DNA上攜帶的編碼抗生素的抗性

2、基因得到表達(dá)，因此，轉(zhuǎn)化了的煙草外植體可在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。第2頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過(guò)組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無(wú)性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。具備條件：（1）高效穩(wěn)定的再生能力（2）較高的遺傳穩(wěn)定性（3）具有穩(wěn)定的外植體來(lái)源（4）對(duì)選擇性抗生素敏感（5）對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性第3頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一外植體的種類葉片、葉柄、子葉、子葉柄莖、花莖、塊莖、莖尖分生組織根合子胚成熟種子第4頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20

3、日，9點(diǎn)50分，星期一第5頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一葉盤法轉(zhuǎn)化雙子葉植物以葉片作為外植體，在葉片上產(chǎn)生傷口，侵染時(shí)農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课?受傷后雙子葉植物分泌的酚類化合物透過(guò)農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜，活化vir區(qū)基因，vir區(qū)基因的活化，促使T-DNA進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)移。T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后整合到核DNA上。 第6頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)接種菌體后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織的固體培養(yǎng)基上，在外植體細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)的同時(shí)，農(nóng)桿菌在外植體切口面也增殖生長(zhǎng)，該兩者共同培養(yǎng)過(guò)程稱之為共培養(yǎng)。是整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中非常重要的環(huán)節(jié)。因

4、為農(nóng)桿菌吸附，T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在這共培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)完成。第7頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一Events An event is the insertion of a particular transgene into a specific location on a chromosome.Conceptions第8頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一Transformation frequency Independent transgenic plants/inoculated immature embryo or callus.Line Th

5、e seedlings from one transgenic cell, namely, one independent successfully transformation event, belong to one line, also are called clones. Generation These transgenic seedlings are T0 generation seedlings, T0 generation mature seeds are T1 generationMeiosis or pollination is the boundary of differ

6、ent generations. 第9頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑儀器：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，臺(tái)式離心機(jī)，培養(yǎng)皿，加樣器 及吸頭，無(wú)菌濾紙；材料：攜帶質(zhì)粒植物表達(dá)(pBI121)載體土壤農(nóng)桿菌LBA4404 煙草無(wú)菌苗試劑： YEB液體培養(yǎng)基（1升）： 酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0 MS鹽： MS大量元素、微量元素、pH7.0； MS基本培養(yǎng)基： MS大量元素、微量元素、有機(jī)物， 3%蔗糖，0.8 %瓊脂，pH5.8；第10頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一實(shí)

7、驗(yàn)步驟第11頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一1. 從平板上挑取含有pBI121的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于50ml YEB液體培養(yǎng)液(含有100mg/L Kan和125mg/L Sm)中，28C振蕩培養(yǎng)至OD600為；2. 4000rpm，室溫離心10分鐘，倒掉上清.3. 用MS鹽溶液（pH7.0）重新懸浮菌體，侵染時(shí)采用MS鹽溶液稀釋至原體積的20-50倍。4. 在超凈臺(tái)上從煙草無(wú)菌苗上切下葉片,切去邊緣和主要葉脈，切成0.40.6cm2大?。坏?2頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一5. 侵染：將切好的外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡10分鐘，取

8、出外植體置于無(wú)菌濾紙上吸去材料表面的菌液。6. 共培養(yǎng)，將侵染過(guò)的外植體接種在上鋪一層濾紙的MS基本培養(yǎng)基，28C暗培養(yǎng)三天。7.外植體暗培養(yǎng)三天后，轉(zhuǎn)到含有抗生素的分化培養(yǎng)基（MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+ Kan 100mg/L + Cb 500mg/L）上，在光照為2000-10000lx，25C條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。8. 三天觀察一次，發(fā)現(xiàn)污染，立刻轉(zhuǎn)入新的相同培養(yǎng)基中第13頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一第14頁(yè)，共16頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)50分，星期一注意事項(xiàng)1煙草無(wú)菌苗上切下葉片后，注意迅速蓋好封口膜。2嚴(yán)格控制葉盤在農(nóng)桿菌菌液中的浸泡時(shí)間。3