臨床免疫學檢驗：第18章 自動化儀器分析

1、第十八章 免疫自動化儀器分析及應用 免疫檢驗自動化 （automation of immunoassays) 是將免疫學反應檢測過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數(shù)據(jù)處理、打印報告和檢測后的儀器清洗等步驟由計算機控制，自動化進行。自動化分析技術自動化免疫比濁分析技術熒光免疫自動分析技術化學發(fā)光自動免疫分析酶聯(lián)免疫分析技術第一節(jié) 自動化免疫濁度分析系統(tǒng)一、免疫透射比濁法1959年Schultze1967年Ritchie1977年sternberg 1.將待檢標本和抗原參考品作適當稀釋。（二）儀器工作過程 2.將待測標本和標準抗原溶液（5個濃度抗原標準品）與適當過量的抗血清

2、混合，在一定條件下，抗原抗體反應完成后，在340nm處測定各管吸光度。 3.按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進行曲線擬合，制備劑量-反應曲線，由計算機處理，計算出抗原濃度。（三）方法評價 優(yōu)點: 靈敏度較單擴高，重復性好，操作簡便，結果準確 不足: 抗體用量較大； 溶液中存在的抗原抗體復合物分子應足夠大 透射比濁測定在抗原抗體反應的第二階段，檢 測需在抗原抗體反應達到平衡后進行，耗時較長。 用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2 m），在遇到相應抗原時，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結合，引起膠乳顆粒凝聚 ，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如圖所示：a為單

3、個膠乳顆粒不阻礙光線透過，b為抗原抗體結合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強。 二、免疫膠乳比濁法（一）原理：（二）方法評價 本法敏感度大大高于普通比濁法，可達ng/L水平，操作簡便，易自動化； 血清中的RF可與IgG Fc段結合，使IgG致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集，用F(ab)2片段代替IgG既可消除此干擾，又可克服IgG致敏膠乳的自凝現(xiàn)象； 免疫膠乳輕度自凝或抗體活性降低會嚴重影響結果。三、免疫散射比濁法(一) 原理II042（dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24 I ：與入射光成角處散射光強度；：入射光的波長； I0：入射光的強度；dn/dc：校正因子，反映了溶液折射

4、指數(shù)和顆粒濃度的變化；M：顆粒分子量； c：濃度；N：阿佛加德指數(shù)；：顆粒到檢測器的距離；：散射光與入射光的夾角（散射夾角）。45Debye散射定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時反應立即開始，在反應的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號波動較大，所獲取的信號計算出的結果會產(chǎn)生一定的誤差。定時散射比濁法是避開抗原抗體反應的不穩(wěn)定階段，即散射光信號在開始反應7.5s2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反應的最佳時段進行讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。 (二)定時散射比濁法（fixed time nephelometry）定時散射比濁法測定原理示意圖 5ul樣本7.5秒(1) 抗體適

5、當過量 (2) 對抗原過量進行閾值限定 45ul樣本(1) 抗原抗體預反應階段 (2) 反應階段(3) 信號檢測 2分鐘6分鐘（2+4分鐘）預反應階段反 應 階 段BN ProSpec全自動特定蛋白分析儀速率散射比濁法是抗原抗體結合反應的動力學測定法。所謂速率是指抗原抗體反應在單位時間內(nèi)形成免疫復合物的量（不是免疫復合物累積的量），連續(xù)測定各時間復合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅12min即可完成。 (三)速率散射比濁法（rate nephelometry）抗原濃度遞增散射光峰值峰值信號與抗原抗體反應之間的關系圖ABCDFGHI儀器測定技術要點

6、 開啟機器，進行定標 反應階段 抗原過量檢測 反應時間（秒）06085散射率抗體過量抗原過量第二峰值信號抗原過量檢測第一次峰值信號加標準抗原(三)方法評價 散射比濁法是目前臨床應用較多的一種方法，本法自動化程度高，具有快速、靈敏、準確、精密等優(yōu)點。采用抗原過量檢測方法，保證了結果的準確性。但儀器和試劑價格比較貴, 對抗體的質(zhì)量要求很高。1.抗原抗體比例 2.抗體的質(zhì)量 3.增濁劑的使用 （一）免疫比濁分析的影響因素 四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應用 4.偽濁度 5.入射光光源和波長 6.結果報告中的計量單位 7.標準曲線制備與質(zhì)量控制第二節(jié)自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)自動化發(fā)光免疫分析儀主要由

7、樣本盤、試劑盤(盒)、溫育反應系統(tǒng)、固相載體分離清洗系統(tǒng)、信號檢測系統(tǒng)和計算機數(shù)據(jù)處理、控制系統(tǒng)組成。 一、吖啶酯標記化學發(fā)光免疫分析儀抗原抗體結合 洗滌、分離 加入氧化劑發(fā)光 信號檢測 ACS：180 SE和ACSCENTAUR化學發(fā)光免疫分析儀ACS：180 SEACSCENTAURci8200i2000sr 酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學發(fā)光或熒光反應的酶來標記抗原或抗體，在抗原抗體反應后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過光信號的強弱來進行被測物的定量。 常用的標記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶(ALP)，常用的發(fā)光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP等

8、。 二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析儀Vitros ECi全自動增強化學發(fā)光酶免分析儀強生公司 堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光免疫分析儀Access全自動酶標記化學發(fā)光免疫分析儀UniCelDxI 800IMMULITE 2000型全自動酶標記化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)（三）堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫分析儀 AXSYM全自動酶標記熒光免疫分析儀日本東曹的AIA-1800型全自動酶標記熒光免疫分析儀三、 電化學發(fā)光免疫分析儀電化學發(fā)光免疫測定工作示意圖ELECSYS 2010型全自動電化學發(fā)光免疫分析儀Modular Analytics E 模塊170型第三節(jié) 自動化熒光免疫分

9、析系統(tǒng)時間分辨熒光免疫分析儀熒光偏振免疫測定儀一、時間分辨熒光免疫分析儀（二）儀器測定技術要點 抗原抗體結合 加入Eu3+螯合抗體 加入酸性增強液 4. 信號檢測 auto DELFIA全自動時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng).美國EG&GWallac公司1. TRFIA分析用的酸性增強液易受環(huán)境、試劑、容器等里面的鑭系元素污染，使本底升高，所用試劑和器材應盡量防塵。 2.TRFIA分析用載體最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其熒光本底低，并有洗滌微孔板的自動裝置，但不同廠家生產(chǎn)的微孔板，所產(chǎn)生的熒光有很大差異，應選擇應用。 （四）注意事項 二、熒光偏振免疫分析儀偏振光和偏振熒光發(fā)生示意圖熒光偏振免疫測定工

10、作原理示意圖1. 抗原抗體反應 2.偏振熒光強度測定 （二） 儀器測定技術要點1.FPIA的結果好壞取決于熒光素標記的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的平均壽命、抗原的相對分子量和復合物的特性等因素。2.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對標本進行預處理，除去干擾成分。 （三）注意事項第四節(jié) 自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng) 根據(jù)全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處理模式，人們通常將全自動酶免分析儀分成二類，一類為分體機，一類為連體機。分體機是由“前處理系統(tǒng)”即全自動樣本處理工作站和“后處理系統(tǒng)”即全自動酶免分析儀兩個獨立的部分組成。連體機是由多個模塊組成，使用一臺計算機、一套操作系統(tǒng)實現(xiàn)了從標本稀釋、加樣到酶標板孵育、洗滌、加

11、試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結果打印全自動進行。條形碼識別系統(tǒng) 樣本架和加樣系統(tǒng) 試劑架 溫育系統(tǒng) 液路系統(tǒng) 洗板系統(tǒng) 酶標板讀數(shù)儀 自動裝載傳遞系統(tǒng) 計算機管理和信息系統(tǒng) （一）儀器組成和性能回溯到 90 年代初期。 全自動酶免分析系統(tǒng)基本特征是單/雙針加樣系統(tǒng)與酶 標板處理系統(tǒng)一體化，多數(shù)孵育位置少于 4 塊板。 加標本將占用較長時間（單針每板需 15 分鐘，三塊板通常需45 分鐘完成加標本工作）。全自動酶免分析系統(tǒng)的發(fā)展目前，市場上出現(xiàn)的酶免工作站主要有：酶免樣本處理系統(tǒng)酶免后處理系統(tǒng)全自動酶免一體機酶免連體機。全自動酶免分析系統(tǒng)的發(fā)展（二）儀器評價優(yōu)點缺點前處理實現(xiàn)加樣自動化，加樣沒有瓶

12、頸不能進行后續(xù)的酶免實驗部分后處理工作臺面大小沒有瓶頸，可以單獨對洗板、孵育位置進行擴充缺少了核心的加樣系統(tǒng)，需要配備前處理實現(xiàn)自動化一體機自動化程度高，酶免實驗全過程自動化工作臺面不能無限制變大，造成處理工作的瓶頸聯(lián)體機實際為多個一體機進行分塊管理，增加了實驗通量占用空間大，性能不夠穩(wěn)定第五節(jié) 免疫自動化儀器分析選擇與應用一、免疫自動化儀器分析選擇原則 實驗室空間和氣候條件 免疫自動化儀器檢測項目的性能指標 實驗室項目檢測速度要求和設備配置 實驗室檢測項目的經(jīng)濟效益因素二、免疫自動化儀器分析 1、免疫比濁分析法主要用于檢測免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、鏈、鏈、免疫球蛋白亞類；補體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白