核酸雜交技術(shù)全解

1、核酸雜交技術(shù)全解核酸雜交技術(shù)全解第1頁目 錄第一節(jié) 核酸分子雜交概念一、核酸探針二、分子雜交信號檢測第二節(jié) 經(jīng)典核酸分子雜交技術(shù)一、固相雜交二、液相雜交核酸雜交技術(shù)全解第2頁目 錄第四節(jié) 影響雜交信號檢測原因一、探針選擇二、探針標識方法三、探針濃度四、雜交率五、雜交溫度六、雜交嚴格謹性七、雜交反應(yīng)時間八、雜交促進劑核酸雜交技術(shù)全解第3頁核酸分子雜交(molecular hybridization of nucleic acid)核酸分子雜交：單鏈核酸分子在適當(dāng)條件下，與含有堿基互補序列異源核酸形成雙鏈雜交體過程。核酸分子雜交技術(shù)：利用核酸分子雜交檢測靶序列一類技術(shù)稱核酸分子雜交技術(shù)。核酸分子雜

2、交技術(shù)當(dāng)前應(yīng)用廣泛，是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列片段有力工具。核酸雜交技術(shù)全解第4頁第一節(jié) 核酸分子雜交概念變性 退火 復(fù)性核酸雜交技術(shù)全解第5頁核酸分子雜交基礎(chǔ)原理1、變性（denaturation）定義：在一定條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團，雙鏈解鏈成為單鏈。 核酸雜交技術(shù)全解第6頁2、融解溫度 (Melting Temperature, Tm)定義：在DNA熱變性時，其A260升高達最大值二分之一時溫度。影響Tm原因： （1）DNA堿基組成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低 （2）溶液離子強度 低離子強度 Tm值越低 高離子強度 T

3、m值越高 （3）pH值 pH值5-9 Tm值改變不顯著 pH11 不利于氫鍵形成 （4）變性劑 干擾堿基堆積力和氫鍵形成核酸雜交技術(shù)全解第7頁3.復(fù)性 變性DNA經(jīng)過一定處理重新形成雙螺旋過程。影響復(fù)性速度原因： DNA濃度 DNA片段大小 DNA片段復(fù)雜性 適當(dāng)復(fù)性溫度 適當(dāng)離子強度核酸雜交技術(shù)全解第8頁重點提醒 分子雜交：指含有一定同源序列兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補配對標準經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈過程。利用這一原理，就能夠使用已知序列單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不一樣起源基因組DNA分子中同源基因或同源序列。核酸雜交技術(shù)全解第9頁一、核酸探針 核酸探針指能

4、與靶核酸序列發(fā)生堿基互補雜交，并能由其標識被特異性檢測核酸分子。核酸雜交技術(shù)全解第10頁探針種類寡核苷酸探針基因組DNA探針cDNA探針RNA探針DNA探針（一）常見探針種類核酸雜交技術(shù)全解第11頁1. DNA探針 最常見核酸探針三大優(yōu)點： 這類探針大多克隆在質(zhì)粒載體中，能夠無限繁殖，制備方法簡便； DNA探針相對不易被降解，普通DNA酶活性能有效地被抑制； DNA探針標識方法較成熟，有各種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機引物法、PCR標識法等，能用于放射性核素和非放射性物質(zhì)標識。 核酸雜交技術(shù)全解第12頁2.RNA探針優(yōu)點：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性雜交較少，未雜交探針可用RNase 降

5、解，降低本底干擾。 缺點：易降解，標識方法復(fù)雜 。核酸雜交技術(shù)全解第13頁3.寡核苷酸探針寡核苷酸探針普通由1750個核苷酸組成。優(yōu)勢：能夠區(qū)分僅僅一個堿基差異靶序列；缺點：寡核苷酸不如長雜化核酸分子穩(wěn)定，需優(yōu)化雜交和洗脫條件以確保寡核苷酸探針雜交特異性。核酸雜交技術(shù)全解第14頁（二）探針長度1.DNA和RNA探針 DNA探針通常為400500個堿基2. 寡核苷酸探針 探針最小長度取決于其靶序列復(fù)雜性核酸雜交技術(shù)全解第15頁（三）核酸探針標識 1. 探針標識物選擇（1）放射性標識（2）非放射性標識依據(jù)標識物摻入情況可分為均勻標識和末端標識探針。核酸雜交技術(shù)全解第16頁不一樣標識類型探針比較：

6、優(yōu)點缺點放射性探針能夠準確定量；靈敏度高；本底低；易于除去舊探針,重新雜交新探針短半衰期探針需臨用前制備；放射性遞減使探針降解；放射性物質(zhì)對人體有害；費用貴非放射性探針對人體危害?。环€(wěn)定，可供長時間內(nèi)連續(xù)使用；檢測過程快；可同時進行不一樣標識探針雜交；本底較低靈敏度不如放射性探針；雜交條件受匯報基團限制；重新雜交新探針比較困難核酸雜交技術(shù)全解第17頁2.探針標識方法選擇 制備探針步驟：探針標識去除未標識核酸探針檢測探針標識效率 核酸探針標識方法(1) DNA切口平移標識法(2) DNA隨機引物標識法(3) DNA末端標識(7) RNA探針標識(4) cDNA探針標識(5) 寡核苷酸探針標識(6

7、) 單鏈DNA探針標識核酸雜交技術(shù)全解第18頁隨機引物：含有各種可能排列次序寡核苷酸片段混合物。DNA聚合酶Klenow片段：保留53DNA聚合酶活性,弱35外切酶活性，無53外切酶活性。（1）DNA隨機引物標識核酸雜交技術(shù)全解第19頁5 3 3 5 32P-個別標識單鏈DNA片段切口原始位置切口最終位置32P-標識DNADNA聚合酶I-32P-dCTP變性DNase I，Mg2+dATP，dGTP，dTTPDNA酶：在雙鏈DNA上隨機打開若干個單鏈缺口，產(chǎn)生3-OH端。大腸桿菌DNA聚合酶：53DNA聚合酶活性；53 外切核酸酶活性。（2）DNA切口平移標識核酸雜交技術(shù)全解第20頁 條件是有

8、5-OH存在，人工合成寡核苷酸最常見；雙鏈DNA需用堿性磷酸酶切除5-P后再標識5p-HO-CpGpTpA35HO-CpGpTpA3T4噬菌體多核苷酸激酶-32P-ATP532p-O-CpGpTpA337，反應(yīng)10min, -32P-ATP 需150 ci/反應(yīng)1) DNA5末端標識堿性磷酸酶(3) DNA末端標識核酸雜交技術(shù)全解第21頁5335完整雙鏈DNA限制性內(nèi)切酶5335-32P-dNTP其它3 種dNTPKlenow DNA聚合酶5335變性53355末端突出DNA3末端標識DNA32P-末端標識單鏈DNA探針2) DNA3末端標識核酸雜交技術(shù)全解第22頁二、分子雜交信號檢測（一）放

9、射性標識探針檢測1、放射自顯影2、液體閃爍計數(shù)法（二）非放射性標識探針雜交檢測1、酶促顯色檢測2、熒光檢測3、化學(xué)發(fā)光檢測4、多探針檢測核酸雜交技術(shù)全解第23頁（一）放射性標識探針檢測1.放射自顯影 放射性雜交檢測基于放射性核素釋放能量將照片紙感光原理。用32P標識雜交最常見檢測方法是放射自顯影。核酸雜交技術(shù)全解第24頁2.液體閃爍計數(shù)法 液體閃爍計數(shù)法工作原理是被測樣品輻射發(fā)出輻射能經(jīng)溶劑分子傳遞給閃爍劑分子，當(dāng)被激發(fā)閃爍劑分子從激發(fā)態(tài)退激為穩(wěn)態(tài)時，以熒光光子形式輻射能量，經(jīng)光電倍增管放大并被測量，就能夠?qū)崿F(xiàn)對放射性核素測定。核酸雜交技術(shù)全解第25頁（二）非放射性標識探針雜交檢測 1.酶促顯

10、色檢測（1）直接檢測酶本身作為標識分子摻入到核酸中去，在洗脫后就可直接進行檢測。酶直接作用于顯色底物，產(chǎn)生顏色沉淀，顯色沉淀可用肉眼檢測。酶直接作用于化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光, 發(fā)光檢測要依賴于對藍光敏感X膠片。這種檢測法常見于寡核苷酸探針雜交，這類雜交反應(yīng)溫度低。 核酸雜交技術(shù)全解第26頁堿性磷酸酶顯色反應(yīng)示意圖核酸雜交技術(shù)全解第27頁HRP酶顯色反應(yīng)示意圖(DAB)(TMB)核酸雜交技術(shù)全解第28頁Dig：半抗原，可經(jīng)過抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)Dig-DNA探針 + 抗Dig抗體-堿性磷酸酶（或辣根過氧化物酶）+ 底物（2）間接檢測 檢測含地高辛、熒光素或生物素標識探針時，就要增加一個將酶連

11、接到雜化核酸分子上步驟。核酸雜交技術(shù)全解第29頁 熒光素：一類能在激發(fā)光作用下發(fā)射出熒光物質(zhì) 熒光顯微鏡觀察、免疫組織化學(xué)法 2熒光檢測 核酸雜交技術(shù)全解第30頁化學(xué)發(fā)光是指化學(xué)反應(yīng)中釋放能量以光形式發(fā)射出來形成檢測信號?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中當(dāng)前常見酶有堿性磷酸酶及辣根過氧化物酶發(fā)射光線強度反應(yīng)了酶活性，反應(yīng)了雜化分子量。 3化學(xué)發(fā)光底物 辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)核酸雜交技術(shù)全解第31頁采取發(fā)色體檢測最大益處是可同時檢測一個以上雜化分子每種探針分別用不一樣匯報基團如生物素、熒光素和地高辛標識并同時與固定在濾膜上核酸雜交采取不一樣鏈霉抗生素或抗體-酶和對應(yīng)底物組合4多探針檢測 核酸雜交技術(shù)

12、全解第32頁 第二節(jié) 經(jīng)典核酸分子雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)全解第33頁核酸分子雜交分類依據(jù)雜交核酸分子種類 DNA與DNA雜交 DNA與RNA雜交 RNA與RNA雜交依據(jù)雜交探針標識 同位素雜交 非同位素雜交依據(jù)雜交介質(zhì) 液相雜交 固相雜交 原位雜交菌落雜交Southern印跡雜交Northern印跡雜交點雜交狹縫雜交核酸雜交技術(shù)全解第34頁分子雜交技術(shù)普通過程 探針制備及標識（同位素或非同位素） 待測核酸樣品制備（分離，純化） 雜交（液相，固相，原位雜交） 雜交后處理（去掉非特異雜交分子） 顯示結(jié)果（顯色，發(fā)光，放射自顯影） 結(jié)果分析核酸雜交技術(shù)全解第35頁固相雜交：先將待測單鏈核酸樣品結(jié)合到固

13、相支持物（常見有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜等）上，然后與溶液中已知序列標識探針進行雜交，放射自顯影分析雜交結(jié)果。核酸雜交技術(shù)全解第36頁（一）反向點雜交反向點雜交（reverse dot blot, RDB）是將各種探針固定在同一膜上，同時參加檢測樣品DNA又互不干擾， 故能一次性篩查出各種不一樣序列。特點：簡單、快捷、特異性強、穩(wěn)定性好較Northern blot省去了電泳和毛細轉(zhuǎn)膜過程核酸雜交技術(shù)全解第37頁（二）Southern印跡雜交 Southern印跡雜交（Southern blot hybridization/ Southern blotting）是指DNA與DNA分子之

14、間雜交。可用于基因組DNA定性與定量分析，重組質(zhì)粒和噬菌體分析等。核酸雜交技術(shù)全解第38頁（二）Southern印跡雜交包含兩個主要過程：將待測定核酸分子經(jīng)過一定方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）。固定于膜上核酸與同位素標識探針在一定溫度和離子強度下退火，即分子雜交過程。核酸雜交技術(shù)全解第39頁Southern印跡雜交基礎(chǔ)步驟： 待測DNA樣品限制性內(nèi)切酶消化 酶切DNA樣品電泳分離 凝膠中DNA變性和Southern轉(zhuǎn)移 探針制備 Southern雜交 雜交結(jié)果檢測核酸雜交技術(shù)全解第40頁限制性內(nèi)切酶消化酶切DNA樣品電泳分離凝膠中DNANa

15、OH變性凝膠中DNA分離帶Southern印跡凝膠中DNA帶被轉(zhuǎn)移到NC膜上標識探針雜交探針雜交帶曝光顯影核酸雜交技術(shù)全解第41頁Southern雜交應(yīng)用 應(yīng)用單基因遺傳病基因診療基因點突變檢測臨床應(yīng)用用于以下疾病產(chǎn)前診療 鐮型細胞貧血 苯丙酮酸尿癥 珠蛋白合成障礙性貧血 假肥大型肌營養(yǎng)不良 血友病 慢性進行型舞蹈病核酸雜交技術(shù)全解第42頁（三）Northern印跡雜交Northern 印跡（Northern blot）雜交是應(yīng)用DNA探針檢測特異mRNA另一個膜上印跡技術(shù)。此項技術(shù)原理和過程與Southern印跡基礎(chǔ)相同，只是檢測分子是RNA，可用來對組織或細胞中mRNA進行定性或定量分析。

16、核酸雜交技術(shù)全解第43頁Northern雜交應(yīng)用 1. RNA病毒檢測2. 基因表示檢測Northern印跡技術(shù)被認為是檢測基因表示水平金標準。 核酸雜交技術(shù)全解第44頁二、液相雜交 液相雜交是指待測核酸和探針都存在于雜交液中，探針與待測核酸在液體環(huán)境中按照堿基互補配對形成雜交分子過程。核酸雜交技術(shù)全解第45頁液相雜交 一個研究最早且操作簡便雜交類型。 原理和反應(yīng)條件與固相雜交基礎(chǔ)相同，僅是將待檢測核酸樣品和雜交探針同時溶于雜交液中進行反應(yīng)。 液相雜交后過量未雜交探針在溶液中除去較困難，同源與異源DNA分子在雜交過程中會發(fā)生競爭，使得雜交結(jié)果分析十分困難。 所以液相雜交應(yīng)用較少核酸雜交技術(shù)全解

17、第46頁三、原位雜交 應(yīng)用核酸探針與組織或細胞中核酸按堿基配對標準進行特異性結(jié)合形成雜交體，然后應(yīng)用組織細胞化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位或基因表示檢測技術(shù)。 核酸雜交技術(shù)全解第47頁（一）基礎(chǔ)操作步驟： 雜交前準備：保持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、保留核酸、增加組織通透性、減低背景。雜交：使探針與細胞中把序列結(jié)合。雜交后處理：鹽溶液漂洗，以降低背景。顯示：依據(jù)核酸探針標志物種類選擇對應(yīng)檢測系統(tǒng)。 核酸雜交技術(shù)全解第48頁 （二）原位雜交應(yīng)用1. 細胞遺傳學(xué)分析產(chǎn)前診療生殖醫(yī)學(xué)中應(yīng)用血液疾病中染色體易位檢測實體瘤研究2. 比較基因組雜交3. 基因圖譜繪制4. 病原學(xué)檢測核酸雜交技術(shù)全解第49

18、頁熒光原位雜交(FISH, Fluorescence in situ Hybridization)利用熒光標識探針與待測標本核酸進行原位雜交，在熒光顯微鏡下對熒光信號進行區(qū)分和計數(shù)，從而對染色體或基因異常細胞、組織標本進行檢測和診療 核酸雜交技術(shù)全解第50頁核酸分子雜交技術(shù)類型 雜交類型檢測目標及范圍Southern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上DNA分子Northern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上RNA分子反向斑點雜交檢測樣品中DNA或RNA分子原位雜交檢測細胞或組織上DNA或RNA分子核酸雜交技術(shù)全解第51頁 第四節(jié) 影響雜交信號檢測原因核酸雜交技術(shù)全解第52頁 在核酸雜

19、交反應(yīng)中影響雜交體形成原因較多，主要有探針選擇、探針標識方法、探針濃度、雜交率、雜交最適溫度、雜交嚴謹性、雜交反應(yīng)時間及雜交促進劑等。核酸雜交技術(shù)全解第53頁一、探針選擇在大多數(shù)情況下，能夠選擇克隆DNA或cDNA雙鏈探針。不過在有些情況下，必須選取其它類型探針如寡核苷酸探針和RNA探針。核酸雜交技術(shù)全解第54頁二、探針標識方法探針標識方法很多，選擇什么標識方法主要視個人習(xí)慣和可利用條件而定。但在選擇標識方法時，還應(yīng)考慮試驗要求，如靈敏度和顯示方法等。普通認為放射性探針比非放射性探針靈敏度高。核酸雜交技術(shù)全解第55頁三、探針濃度隨探針濃度增加，雜交率也增加。在較窄范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。探針濃度過低會降低雜交靈敏度，過高又會增加背景染色。普通認為，最正確標準是應(yīng)用與靶核苷酸探針