蛋白質(zhì)分選與膜泡運(yùn)輸

1、第八章 蛋白質(zhì)分選與膜泡運(yùn)輸?shù)?頁第一節(jié) 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分選第二節(jié) 細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸本章主要內(nèi)容第2頁第一節(jié) 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分選細(xì)胞質(zhì)中合成上萬種蛋白質(zhì)被分別運(yùn)輸?shù)礁髯蕴囟ú课?，說明細(xì)胞中必定存在確保蛋白質(zhì)準(zhǔn)確分選、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。這是經(jīng)過一定結(jié)構(gòu)和一系列復(fù)雜過程來完成。第3頁一、信號(hào)假說與蛋白質(zhì)分選信號(hào)信號(hào)假說(signal hypothesis)指分泌蛋白N端序列作為信號(hào)肽，指導(dǎo)分泌性蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上合成，在蛋白合成結(jié)束之前信號(hào)肽被切除。它提出源于1972年 C.Milstein等發(fā)覺在骨髓瘤細(xì)胞中得到免疫球蛋白分子N端要比分泌到細(xì)胞外免疫球蛋白N端多出一截。第4頁Gunter Blobel 在上述研

2、究基礎(chǔ)上，著重研究了轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞新合成蛋白質(zhì)怎樣與特定細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用機(jī)理。他最先提出了“信號(hào)假說”：分泌出胞蛋白質(zhì)含有一個(gè)內(nèi)在信號(hào)能夠引導(dǎo)他們準(zhǔn)確經(jīng)過生物膜。這些信號(hào)是一段與蛋白整合在一起氨基酸序列，并推測(cè)蛋白質(zhì)是經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上一個(gè)通道來完成。1975年，Blobel闡述了蛋白質(zhì)跨膜主要步驟。第5頁經(jīng)過與其它研究組合作，Gunter Blobel發(fā)覺蛋白質(zhì)經(jīng)過其它細(xì)胞器時(shí)含有相同內(nèi)源性信號(hào)。1980年提出了蛋白質(zhì)跨膜定位普遍機(jī)理。每種蛋白質(zhì)可攜帶本身細(xì)胞定位信號(hào)肽。這段特異氨基酸序列決定了一個(gè)蛋白質(zhì)是穿過特定細(xì)胞器膜、整合到細(xì)胞膜、還是分泌出胞命運(yùn)。隨即，信號(hào)假說不但被證實(shí)是正確，而且在生物

3、界還是普遍存在，在酵母、植物和動(dòng)物細(xì)胞中含有相同作用機(jī)理。第6頁Gunter Blobel 因信號(hào)序列控制蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移與定位研究結(jié)果，獲1999年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。Germany Gunter Blobel 60年代末加入了紐約Rockefeller研究院著名George Palade細(xì)胞生物學(xué)研究室。在那里二十年間，科學(xué)家們針對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和新合成蛋白質(zhì)出胞轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行了深入研究。第7頁現(xiàn)已確認(rèn)，指導(dǎo)分泌性蛋白在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成決定原因是蛋白質(zhì)N端信號(hào)肽（signal peptide）。細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中信號(hào)識(shí)別顆粒（signal recognition particle, SRP）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上

4、信號(hào)識(shí)別顆粒受體（又稱停泊蛋白，docking protein,DP）等因子幫助完成這一過程 信號(hào)肽(signal piptide）指存在于蛋白質(zhì)N端，通常有16-26個(gè)氨基酸殘基，其中包含疏水關(guān)鍵區(qū)、信號(hào)肽C端和N端3個(gè)部分。第8頁SRP是一個(gè)核糖核蛋白復(fù)合體，由6種多肽和1個(gè)7S RNA組成復(fù)合物，它既可與新生肽信號(hào)序列和核糖體結(jié)合，又可與停泊蛋白結(jié)合。SRP have three main active sites:One that recognizes and binds to ER signal sequence;One that interacts with the ribosom

5、e to block further translation;One that binds to the ER membrane (docking protein) 信號(hào)識(shí)別顆粒 (signal recognition particle, SRP)第9頁信號(hào)識(shí)別顆粒受體 (SRP receptor)信號(hào)識(shí)別顆粒受體(SRP receptor)，又稱停泊蛋白(docking protein,DP)，由兩個(gè)亞基組成，可特異地與SRP結(jié)合并起始肽鏈向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔轉(zhuǎn)運(yùn)，使肽鏈延長繼續(xù)進(jìn)行。亞基含有GTP酶活性。第10頁易位子 (translocon) 易位子(Translocon)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，直徑約

6、8.5 nm 通道蛋白，是中心有一直徑為2 nm 通道蛋白復(fù)合體，參加新生蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。轉(zhuǎn)位鏈相關(guān)膜蛋白translocating chain-associated membrane protein,TRAM proteinSec61蛋白(酵母secretion gene 產(chǎn)物)，易位子主要成份，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Sec61p與Sec61和Sec61 形成復(fù)合物，能與核糖體大亞基緊密結(jié)合，從而把核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜連接起來。第11頁共轉(zhuǎn)移 (cotranslocation)：肽鏈邊合成邊轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中轉(zhuǎn)運(yùn)方式，也叫翻譯同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)。分泌蛋白等在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上合成與轉(zhuǎn)運(yùn)第12頁開始轉(zhuǎn)移序列(Start-tra

7、nsfer Sequence)，引導(dǎo)肽鏈穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜信號(hào)肽序列；停頓轉(zhuǎn)移序列(Stop-transfer Sequence)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜有很強(qiáng)親和力而結(jié)合在脂雙層之中，這段序列不再轉(zhuǎn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中?？缒な杷畢^(qū)第13頁膜結(jié)合核糖體蛋白質(zhì)合成與轉(zhuǎn)運(yùn) 第14頁Synthesis and insertion into the ER membrane of the GLUT1 glucose transporter and other proteins with multiple transmembrane a-helical segments. The N-terminal a helix functi

8、ons as an internal, uncleaved signal-anchor sequence (red), directing binding of the nascent polypeptide chain to the rER membrane and initiating cotranslational insertion. Both SRP and the SRP receptor are involved in this step. Following synthesis of helix 2, which functions as a stop-transfer mem

9、brane-anchor sequence, extrusion of the chain through the translocon into the ER lumen ceases. The first two a helices then move out of the translocon into the ER bilayer, anchoring the nascent chain as an a-helical hairpin. The C-terminus of the nascent chain continues to grow in the cytosol. Subse

10、quent a-helical hairpins could insert similarly, although SRP and the SRP receptor are required only for insertion of the first signalanchor sequence. Although only six transmembrane a helices are depicted here, GLUT1 and proteins of similar structure have twelve or more. H. P. Wessels et al., Cell

11、55:61. 第15頁二、蛋白質(zhì)分選基本路徑與類型第16頁蛋白質(zhì)分選大致可分為兩條路徑：共轉(zhuǎn)移和后轉(zhuǎn)移。共轉(zhuǎn)移(cotranslocation)：肽鏈邊合成邊轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中轉(zhuǎn)運(yùn)方式，也叫翻譯同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)。 后轉(zhuǎn)移(post translocation)，蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中合成后，再轉(zhuǎn)移到細(xì)胞器中，又稱翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)。如線粒體、葉綠體及過氧化物酶體中蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。這種轉(zhuǎn)運(yùn)方式在蛋白質(zhì)跨膜過程中不但需要ATP使多肽去折疊，還需要一些蛋白幫助(如熱休克蛋白Hsp70)使其能夠正確地折疊成有功效蛋白。第17頁分選路徑第18頁第19頁假如從蛋白質(zhì)分選轉(zhuǎn)運(yùn)方式或機(jī)制來看，又可將其分為4類：蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(tran

12、smembrane transport)：主要指在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中合成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、質(zhì)體(包含葉綠體)和過氧化物酶體等細(xì)胞器。膜泡運(yùn)輸(vesicular transport)選擇性門控轉(zhuǎn)運(yùn)(gated transport)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)第20頁蛋白質(zhì)分選信號(hào) 每種蛋白質(zhì)含有一個(gè)或各種信號(hào)序列或跨膜疏水區(qū)，從而決定了它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)準(zhǔn)確定位。信號(hào)序列（signal sequence）指存在于蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上線性序列，信號(hào)序列對(duì)所引導(dǎo)蛋白質(zhì)沒有特異性要求，每一個(gè)信號(hào)序列決定特殊蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方向。進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽序列，進(jìn)入線粒體、葉綠體和過氧化物酶體稱導(dǎo)肽或前導(dǎo)肽(leader

13、 peptide)，以及后面要講核定位序列。第21頁功效信號(hào)序列輸入細(xì)胞核-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-輸出細(xì)胞核-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile-輸入線粒體+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-輸入質(zhì)體+H3N-Met-Val-Ala-Met-Ala-Met-Ala-Ser-Leu-Gln-Ser-Ser-Met-Ser-Ser-Leu-S

14、er-Leu-Ser-Ser-Asn-Ser-Phe-Leu- Gly-Gln-Pro-Leu-Ser-Pro-Ile-Thr-Leu-Ser-Pro-Phe-Leu- Gln-Gly-輸入過氧物酶體-Ser-Lys-Leu-COO-輸入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys- Glu-Val-Phe-Gln-返回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-（KDEL）由質(zhì)膜到內(nèi)體Tyr-X-X-第22頁其它分選信號(hào)

15、：存在于已合成蛋白質(zhì)中，能被特異受體所識(shí)別，從而引導(dǎo)蛋白質(zhì)抵達(dá)適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)。如溶酶體分選信號(hào)M6P、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分選信號(hào)KDEL(賴-天-谷-亮)等。信號(hào)斑（signal patch）：存在于完成折疊蛋白質(zhì)中，組成信號(hào)斑信號(hào)序列之間能夠不相鄰，折疊在一起組成蛋白質(zhì)分選信號(hào)。第23頁Wild-type: T-antigen in nucleusMutant-type: T-antigen in cytosol第24頁蛋白質(zhì)合成與分選第25頁參閱：彭佳師，龔繼明. 信號(hào)肽與蛋白質(zhì)分選轉(zhuǎn)運(yùn). 植物生理學(xué)報(bào)，47（1）：9-17.第26頁三、細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸?shù)?7頁細(xì)胞必須含有準(zhǔn)確而有效地機(jī)制，確保在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上

16、合成各種蛋白質(zhì)，在高爾基體TGN等結(jié)構(gòu)中經(jīng)過形成不一樣轉(zhuǎn)運(yùn)泡而被分選、運(yùn)輸，并在特定時(shí)間和位點(diǎn)發(fā)揮其特定功效。完成細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸最少需要10種以上運(yùn)輸小泡，每種小泡表面都有特殊標(biāo)志以確保其物質(zhì)準(zhǔn)確運(yùn)輸。當(dāng)前，了解較清楚有3種有被小泡，分別是：COP有被小泡COP有被小泡網(wǎng)格蛋白有被小泡第28頁1.COP有被小泡組裝與運(yùn)輸介導(dǎo)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體物質(zhì)運(yùn)輸。由5種蛋白亞基組成，首先從酵母中判定。其中Sar為一個(gè)小G蛋白，調(diào)整膜泡裝配與去裝配。COP有被小泡是經(jīng)過可溶性包被蛋白COP復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上組裝形成。ER腔中可溶性蛋白經(jīng)過與選擇性跨膜蛋白腔面一端結(jié)合而被募集。同時(shí)，選擇性跨膜蛋白胞質(zhì)面一端信

17、號(hào)序列以及v-SNARE被COP蛋白識(shí)別，從而形成包含有貨物有被小泡。隨即在小分子GTP結(jié)合蛋白（Sar1）參加下脫被并定位到高爾基體cis面。脫被后暴露v-SNARE與高爾基體cis面同類蛋白t-SNARE相互配合，介導(dǎo)膜泡和靶膜融合，內(nèi)含物釋放進(jìn)入高爾基體。被脫去包膜蛋白再循環(huán)利用。第29頁第30頁第31頁動(dòng)物細(xì)胞中已發(fā)覺20各種SNAREs，位于運(yùn)輸小泡上叫作v-SNAREs，位于靶膜上叫作t-SNAREs。v-和t-SNAREs都含有一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域，能相互纏繞形成跨SNAREs復(fù)合體（trans-SNAREs complexes），將運(yùn)輸小泡膜與靶膜拉在一起，實(shí)現(xiàn)運(yùn)輸小泡特異性停泊和融

18、合。第32頁2.COPI 衣被小泡功效：負(fù)責(zé)回收、轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸蛋白（escaped proteins）返回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，由7種蛋白組成?；厥招盘?hào)：Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白（如SRP受體）在C端有一個(gè)不一樣回收信號(hào)Lys-Lys-X-X。COPI 還能夠介導(dǎo)高爾基體不一樣區(qū)域間蛋白質(zhì)運(yùn)輸。第33頁COPI含有7種蛋白亞基，其中ARF是一個(gè)調(diào)整膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)GTP結(jié)合蛋白，包被蛋白復(fù)合物裝配與去裝配依賴于ARF。第34頁順行轉(zhuǎn)運(yùn)(anterograde transport)逆行轉(zhuǎn)運(yùn)(retrograde transport)第35頁3. 網(wǎng)格蛋白有被小泡相關(guān)運(yùn)輸路徑：第36頁

19、結(jié)構(gòu)：由3個(gè)重鏈和3個(gè)輕鏈組成，形成一個(gè)含有3個(gè)曲臂形狀。許多籠形蛋白曲臂部分交織在一起，形成含有5或6邊形網(wǎng)孔籠子。銜接蛋白(adaptin)：介于籠形蛋白與配體受體復(fù)合物之間，起連接作用。當(dāng)前最少發(fā)覺4種，分別結(jié)合不一樣類型受體，形成不一樣性質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)小泡。第37頁 一個(gè)小分子GTP結(jié)合蛋白，在深陷有被小窩頸部裝配成環(huán)，發(fā)動(dòng)蛋白水解與其結(jié)合GTP引發(fā)頸部縊縮，最終脫離質(zhì)膜形成網(wǎng)格蛋白有被小泡。發(fā)動(dòng)蛋白（dynamin）第38頁介于網(wǎng)格蛋白與配體受體復(fù)合物之間，起連接作用。當(dāng)前最少發(fā)覺4種，分別結(jié)合不一樣類型受體，形成不一樣性質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)小泡。 連接蛋白（adapter protein/ adapti

20、n ）第39頁第40頁第41頁4. 膜泡運(yùn)輸定向機(jī)制選擇性融合是確保細(xì)胞內(nèi)定向膜流原因之一第42頁SNAREs：soluble NSF attachment protein receptorNSF：N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感因子，具ATP酶活性SNAP：soluble NSF attachment protein選擇性融合主要是由以下蛋白作用造成：第43頁SNAREs in vesicle transport第44頁Rab蛋白(Rab protein)在小泡運(yùn)輸與融合中調(diào)整作用 Rab蛋白是一類調(diào)整型單體GTPase, 全部Rab蛋白都是由大約200個(gè)氨基酸組成。它能夠結(jié)合GTP并將其水解,所以認(rèn)為Rab蛋白經(jīng)過GTP循環(huán)來調(diào)整小泡融合 第45頁供體膜上鳥嘌呤核苷釋放蛋白(GNRP)識(shí)別胞質(zhì)溶膠中特異Rab蛋白，誘導(dǎo)GDP釋放并和GTP結(jié)合，進(jìn)而改變Rab蛋白構(gòu)型，改