干細胞的體外培養(yǎng)概述

1、干細胞體外培養(yǎng)第1頁一、干細胞概念干細胞(stem cells, SC)是一類含有自我復(fù)制能力(self-renewing)多潛能細胞，在一定條件下，它能夠分化成各種功效細胞。干細胞是一個未充分分化，尚不成熟細胞，含有再生各種組織器官和人體潛在功效，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細胞”。 第2頁干細胞幾個主要特征含有自我更新能力與自我維持能力，能夠無限增殖分裂。干細胞一旦形成，在機體內(nèi)終生都含有自我更新能力，以維持本身數(shù)目標恒定。既含有生理性更新能力，也含有對損傷或疾病造成反應(yīng)有修復(fù)能力，如骨髓間充質(zhì)干細胞等。 干細胞維持自穩(wěn)性機制：對稱分裂和不對稱分裂第3頁 4 干細胞對稱分裂和不對稱分裂對稱分裂 （s

2、ymmetry division）不對稱分裂 （asymmetry division）干細胞 分 化 細 胞 干細胞 分化細胞第4頁干細胞幾個主要特征干細胞本身不是終末分化細胞；含有多向分化能力（多能性或全能性），即能夠分化發(fā)育成各種胚層組織細胞（ES細胞），或能夠分化成為本系統(tǒng)各譜系細胞（特定組織干細胞，如造血干細胞）。第5頁干細胞幾個主要特征干細胞自我更新與分化需要特定微環(huán)境，也就是說干細胞往哪一個方向分化，必須在該細胞生存特定微環(huán)境前提下進行分化。已經(jīng)有很多試驗表明，如將ES細胞種植入小鼠大腦內(nèi)，這些干細胞將向神經(jīng)系統(tǒng)分化。在不一樣生長因子刺激下干細胞可表現(xiàn)出不一樣分化潛能第6頁干細胞幾

3、個主要特征干細胞分裂產(chǎn)生子細胞只能有兩種命運保持為干細胞或分化為特定細胞。第7頁二、干細胞分類1、按分化潛能大小來分類:全能干細胞（ Totipotent stem cell ）：能分化成全部組織和器官干細胞，它含有形成完整個體分化潛能。如受精卵，胚胎干細胞。多能干細胞（ pluripotent stem cell ），含有分化出各種組 織細胞潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體能力，發(fā)育 潛能受到一定限制。如骨髓多能造血干細胞是經(jīng)典例 子，它可分化出最少十二種血細胞 。專能干細胞（ unipotent stem cell ），這類干細胞只能向 一個類型或親密相關(guān)兩種類型細胞分化，如上皮組織 基底層

4、干細胞、肌肉中成肌細胞等。第8頁2、依據(jù)起源來分: 起源于胚胎- 胚胎干細胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖細胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 起源于成體組織- 成體干細胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）第9頁胚胎干細胞指從著床前胚胎內(nèi)細胞團（桑椹胚）或原始生殖細胞取得一個含有多潛能性、可發(fā)育成為各種細胞、同時可保持不分化狀態(tài)而連續(xù)生長克隆細胞系。它能夠無限增殖并分化成為全身200各種細胞類型，深入形成機體全部組織、器官。為全能干細胞。 第10頁成體干細胞是成體組織內(nèi)含有自我更新及分化一個或一個以上子細胞未

5、成熟細胞。起源于成年組織或器官，普通含有組織特異性，只能分化成特定細胞或組織。為多能干細胞或單能干細胞，如造血干細胞和上皮干細胞等。 第11頁3、依據(jù)干細胞組織發(fā)生名稱進行分類:胎胎干細胞造血干細胞骨髓間質(zhì)干細胞肌肉干細胞成骨干細胞內(nèi)胚層干細胞視網(wǎng)膜干細胞胰腺干細胞第12頁三、干細胞研究歷史情況 1959年，美國首次報道了經(jīng)過體外受精（IVF）動物。 60年代，幾個近親種系小鼠睪丸畸胎瘤研究表明其起源于胚胎生殖細胞（embryonic germ cells, EG細胞）,此工作確立了胚胎癌細胞（embryonic carcinoma cells, EC細胞）是一個干細胞。 1968年，Edwa

6、rds 和Bavister 在體外取得了第一個人卵子。 70年代，EC細胞注入小鼠胚泡產(chǎn)生雜合小鼠。培養(yǎng)EC細胞作為胚胎發(fā)育模型，即使其染色體數(shù)目屬于異常。1978年，第一個試管嬰兒在英國誕生。 第13頁1981年，從小鼠胚泡內(nèi)細胞團分離出小鼠ES細胞，并建立了小鼠ES細胞體外培養(yǎng)條件。將ES細胞注入小鼠，能誘導(dǎo)形成畸胎瘤。 1984-1988年，Anderews 等人從人睪丸畸胎瘤細胞系Tera-2中產(chǎn)生出多能、可判定（克隆化）細胞，稱之為胚胎癌細胞（embryonic carcinoma cells, EC細胞）。克隆人EC細胞在視黃酸作用下分化形成神經(jīng)元樣細胞和其它類型細胞。 1989年

7、，Pera 等分離了一個人EC細胞系，此細胞系能產(chǎn)生出三個胚層組織。這些細胞是非整倍體（比正常細胞染色體多或少），他們在體外分化潛能是有限。 第14頁1998年美國有兩個小組分別培養(yǎng)出了人多能干細胞： James A. Thomson在 Wisconsin大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)研究小組方法是：人卵體外受精后，將胚胎培育到囊胚階段，提取 inner cell mass細胞，建立細胞株。 John D. Gearhart在 Johns Hopkins大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)另一個研究小組方法是：從受精后59周人工流產(chǎn)胚胎中提取生殖母細胞( primordial germ cell )，建立細胞株。1999年12月，美國科學(xué)家在

8、美國科學(xué)院院刊匯報說，小鼠肌肉組織成體干細胞能夠“橫向分化”為血液細胞。隨即，世界各國科學(xué)家相繼證實，成體干細胞，包含人類成體干細胞含有可塑性。1999年12月，干細胞研究進展被科學(xué)雜志評選為該年度世界十大科學(xué)進展之首。日本Yamanaka研究小組和美國James Thomson 研究小組分別取得誘導(dǎo)多能性干細胞 （induced pluripotent stem cell，iPS細胞）。 第15頁至今已分離得到胚胎干細胞物種有：小鼠胚胎干細胞（1981）金黃地鼠（1988）、貂（1993）、豬（1994，1997）、雞（1996）、恒河猴（1995）、絨猴（1996）。分離得到人胚胎干細胞（

9、1998），胚胎生殖細胞（1998），當前不停報道成年組織起源干細胞。第16頁四、胚胎干細胞體外培養(yǎng)（一）技術(shù)原理基本標準：促進ES增殖同時，維持其未分化二倍體狀態(tài)。有喂養(yǎng)層（feeder layer）培養(yǎng)法：以小鼠成纖維細胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系（STO）或小鼠胚胎成纖維細胞（ Mouse Embryo Firbroblasts, MEF）制備喂養(yǎng)細胞單層，主要是利用其分泌生長因子FGF和抑制干細胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干細胞在體外克隆而不分化。無喂養(yǎng)層培養(yǎng)法：利用各種能分泌抑制分化因子細胞制備條件培養(yǎng)基或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組LIF制備條件培養(yǎng)基。第17頁（二）

10、基本過程喂養(yǎng)層細胞制備或條件培養(yǎng)基制備胚胎制備和培養(yǎng)胚胎干細胞分離胚胎干細胞培養(yǎng)胚胎干細胞判定凍存與復(fù)蘇細胞克隆形態(tài)堿性磷酸酶檢測核型判定分化能力觀察嵌合能力測定第18頁1、喂養(yǎng)層細胞培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞（ MEF）：取孕12.5-14.5 d鼠胚胎軀干，以植塊培養(yǎng)法或分散細胞培養(yǎng)法制備，取第三代至第五代細胞作為喂養(yǎng)層細胞。STO細胞：按照普通已建細胞系培養(yǎng)方法。DMEM加10%小牛血清作為培養(yǎng)液。采取胎數(shù)多小鼠一次大量培養(yǎng)MEF凍存，用時復(fù)蘇。第19頁 MEF和STO優(yōu)缺點：MEF分泌促進胚胎干細胞增殖和抑制分化因子能力比STO強，STO作喂養(yǎng)細胞時常需在培養(yǎng)基中加入LIF。MEF不能長久

11、傳代，需經(jīng)常準備懷孕小鼠制備第三代至第五代細胞，STO則可長久傳代培養(yǎng)。MEF不具耐藥性，不能作為轉(zhuǎn)染外源性基因胚胎干細胞篩選取。SNL細胞為轉(zhuǎn)染了neor抗性基因和LIF基因STO細胞，可分泌足夠抑制分化因子，并因帶有neor抗性基因可用于轉(zhuǎn)基因胚胎干細胞篩選。胚胎干細胞培養(yǎng)過程中，死亡MEF或STO染色體可能造成胚胎干細胞突變及影響正常核型保持。不易取得純胚胎干細胞作為生化和分子生物學(xué)方面分析。使用前如用絲裂霉素C處理，如清洗不徹底，殘余絲裂霉素C會影響胚胎干細胞增殖。第20頁報道人源性滋養(yǎng)層細胞：人骨髓起源間充質(zhì)干細胞胎兒肌肉或胎兒皮膚細胞新生兒包皮成纖維細胞成人子宮內(nèi)膜細胞人胎盤成纖維

12、細胞人胚胎干細胞經(jīng)體內(nèi)分化獲取間充質(zhì)干細胞第21頁2、喂養(yǎng)單層制備MEF或STO連成一片，以含10g/ml絲裂霉素培養(yǎng)液370C作用2-3 h（如細胞層較薄，也可縮短至30min-1.5h），或射線照射（劑量為30-100Gy）。棄含絲裂霉素培養(yǎng)液，PBS洗5次， 射線處理者不用清洗。消化細胞，制備懸液種植至用0.1%明膠處理過（0.1%明膠水溶液覆蓋培養(yǎng)瓶表面，室溫2h以上）培養(yǎng)瓶，種植細胞數(shù)：MEF7.5104-105個/cm2，STO為5104個/cm2。培養(yǎng)至細胞連成一片沒有間隙（中間可補加處理過細胞），制備好喂養(yǎng)單層置培養(yǎng)箱，5天內(nèi)使用，使用前換成干細胞培養(yǎng)液。第22頁觀察：好喂養(yǎng)單

13、層，細胞連成一片，無間隙，死亡細胞和雜細胞極少。MEF和STO產(chǎn)生抑制分化因子一部分分泌到培養(yǎng)液中，一部分錨定在細胞外基質(zhì)上。無間隙喂養(yǎng)單層確保了胚胎干細胞都能與喂養(yǎng)層細胞接觸而到達最正確效果。第23頁3、用于培養(yǎng)胚胎干細胞條件培養(yǎng)基直接在胚胎干細胞培養(yǎng)液中加入重組LIF，使終濃度為1000U/ml。Baffalo大鼠肝細胞株BRL條件培養(yǎng)基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干細胞分化因子DIF。搜集培養(yǎng)72h培養(yǎng)液，過濾除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干細胞培養(yǎng)液，再添加8-10%胎牛血清。年紀 2-3周大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干細胞分化因子。搜集1-6

14、代細胞培養(yǎng)液，過濾除菌，用前6份+3份胚胎干細胞培養(yǎng)液+1份胎牛血清。第24頁4、胚胎干細胞分離和培養(yǎng)（1）培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液要用超純水或五蒸水，不能有細菌內(nèi)毒素污染，水要現(xiàn)用現(xiàn)制。高糖DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，葡萄糖濃度為（4.5g/L）：有利于囊胚貼壁、內(nèi)細胞團增殖及胚胎干細胞集落形成。使用前還要添加-巰基乙醇（0.1mmol/L）或單硫甘油（ 0.15mmol/L）：保護細胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)中巰基不被氧化，促進胚胎干細胞貼壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺點。第25頁血清缺點：成份復(fù)雜，不利于整合到胚胎干細胞基因組中外源性基因功效測定；可能含有一些未知促進胚胎干細胞分化

15、因子；含有微量血紅蛋白和內(nèi)毒素，干擾胚胎干細胞生長。無血清胚胎干細胞培養(yǎng)液無上述缺點，但細胞貼附力不如有血清培養(yǎng)基。第26頁（2）胚胎干細胞分離小鼠：母小鼠超數(shù)排卵交配（注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素）胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）母小鼠取胚胎胚胎培養(yǎng)：培養(yǎng)皿內(nèi)制備直徑0.5cm左右露滴狀培養(yǎng)液液滴，并覆蓋透明石蠟油，胚胎置于液滴中培養(yǎng)胚胎干細胞分離：普通分離法、免疫外科法，棄除滋胚層細胞，取得內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM），并分散為3-4個細胞在一起細胞團第27頁人胚胎干細胞起源 a.自終止妊娠（5-9周人工流產(chǎn)）胎兒中提取生殖母細胞( primor

16、dial germ cell )。 28 Gearhart法第28頁29 b.取自體外受精胚胎囊胚期內(nèi)層細胞。用這種方法，每個胚胎可取得1520個細胞用于培養(yǎng)。 Thomson法第29頁c.經(jīng)過體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)（SCNT技術(shù)）獲取30 第30頁其它干細胞分離與純化 干細胞表面有許多特殊標識，以造血系統(tǒng)為例，干細胞表面標志有Sca-1和c-kit等。另外各種成體干細胞還有各自獨特標識物，如人造血干細胞表現(xiàn)為CD34+和Thy10+而CD10，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆為陰性另外干細胞還有不一樣于普通分化細胞物理特征，比如干細胞不被染料Hoechst33324和Rhodam

17、ine123染色。利用這些特征及表面標志，采取熒光細胞分離器從單細胞懸液中即可分離純化干細胞。 第31頁（3）胚胎干細胞培養(yǎng)有喂養(yǎng)層細胞培養(yǎng)：將內(nèi)細胞團吸置處理過喂養(yǎng)層上，一個內(nèi)細胞團放置一個孔，370C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)2d后出現(xiàn)小集落，并逐步增大，6-10d可消化傳代，消化時，消化30s后棄消化液，殘余消化液繼續(xù)作用，當喂養(yǎng)單層出現(xiàn)裂隙（或顯微鏡下細胞之間分開），終止消化，普通為2-3min加適量培養(yǎng)液，輕輕吹打成單細胞懸液，接種新喂養(yǎng)層擴大培養(yǎng)。無喂養(yǎng)層培養(yǎng)：明膠包被培養(yǎng)板，條件培養(yǎng)基。已建系胚胎干細胞：將已培養(yǎng)2-3d生長旺盛干細胞消化成單細胞懸液，添加新培養(yǎng)液，按照1：3或1

18、：6百分比轉(zhuǎn)鐘。第32頁注意事項：最初分離內(nèi)細胞團以3-4個細胞團為宜，但集落形成后，傳代過程中一定要消化成單細胞，不然胚胎干細胞會相互誘導(dǎo)，易于分化。培養(yǎng)條件要一直如一。為了增強胚胎干細胞粘附力，除明膠包被外，還能夠用纖維連接蛋白和多聚賴氨酸等促進粘附。第33頁（4）培養(yǎng)結(jié)果hES細胞集落（10）胚胎干細胞呈集落狀（島嶼狀）生長，邊緣整齊，表面平滑，結(jié)構(gòu)致密，隆起生長，細胞之間界限不清。消化成單細胞后細胞小而圓，核大，胞漿小。第34頁A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell第35頁A cultur

19、e dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells. Each red-stained spot represents an individual colony comprised of hundreds or thousands of stem cells.第36頁5、胚胎干細胞凍存和復(fù)蘇凍存液：胚胎干細胞培養(yǎng)液+10%-15%DMSO。凍存細胞密度：106-107個/ml凍存與復(fù)蘇方法同普通細胞。LIF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，依然用不含LIF胚胎干細胞培養(yǎng)液凍存。第37頁（三）胚胎干細胞判定1、 ES細胞生

20、物學(xué)特征（1）ES細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型ES細胞含有與早期胚胎細胞相同形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個或幾個核仁。細胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了二倍體性質(zhì)。正常ES細胞染色體正常，如發(fā)生異常則其極難發(fā)育分化形成動物個體。 第38頁（2）ES細胞生長特征ES細胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長，細胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細胞界限不清，克隆周圍有時可見單個ES細胞和分化扁平狀上皮細胞。 ES細胞增殖快速，每1824 h分裂增殖 1次。另外，其還能夠在體外進行選擇、操作、凍存。凍存細胞可在需要時隨時解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特征，而且來自一個克隆細胞

21、含有一樣特征。第39頁40 人胚胎干細胞(hES)特點 形態(tài)：圓形或橢圓，體積較小，核質(zhì)比較大，體外抑制分化培養(yǎng)時呈鳥巢狀，集落生長并緊密堆積，細胞界限不顯著。第40頁 （3）ES細胞高度分化潛能 ES細胞在體外需在喂養(yǎng)層細胞上培養(yǎng)才能維持其未分 化狀態(tài)，一旦脫離喂養(yǎng)層就自發(fā)地進行分化。在單層培養(yǎng)時細胞自發(fā)分化成各種細胞， 懸浮培養(yǎng)中： “簡單類胚體” “囊狀胚體” 細胞分化物。ES細胞可進行誘導(dǎo)分化 *用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90以上ES細胞 分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞， *聚集培養(yǎng)ES細胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮 心肌細胞。 *將ES細胞注射到同源動物皮下，可形成組織瘤，其細胞 組

22、成可代表3個胚層細胞。 *用ES細胞作核供體進行細胞核移植，能夠得到可發(fā)育重 構(gòu)胚和動物個體。第41頁 （4）堿性磷酸酶表示 許多資料表明，小鼠、大鼠桑椹胚細胞和囊胚細胞都有堿性磷酸酶（AKP）表示，小鼠EC細胞和ES細胞中均含有豐富AKP。而在已分化EC細胞和ES細胞中AKP呈弱陽性或陰性。豬、兔桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。所以，AKP慣用來作為判定EC細胞或ES細胞分化是否標志之一。第42頁 （5）胚胎階段特異性細胞表面抗原表示 早期胚胎細胞表面均表示胚胎階段特異性表面抗原（SSEA-1）。在胚胎原始外胚層細胞、ES細胞、EC細胞和原始生殖細胞表面均可檢測到SSEA-1表示。小鼠SSEA

23、-1表示自8細胞期開始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細胞全部呈強陽性，晚期囊胚中部分ICM呈強陽性，部分呈弱陽性，少部分為陰性。所以，SSEA也常作為ES細胞判定一個標志。第43頁 2、ES細胞全能性主要表達在以下幾方面： 形成畸胎瘤。將ES細胞注人同源動物皮下可形成畸胎瘤，包含三個胚層細胞； 形成類胚體。培養(yǎng)ES細胞在非粘附底物中懸浮生長，或控制增殖細胞數(shù)目，能夠使之生成類胚體，它是一個與畸胎瘤相同各種細胞系混雜集合體、含有三個胚層組織； 第44頁 直系分化。經(jīng)過控制ES細胞生長環(huán)境，或遺傳操縱特定基因表示，ES細胞可直接分化成某特定種系細胞，比如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和Neu

24、roD3轉(zhuǎn)人ES細胞，可使之分化為神經(jīng)細胞； 形成嵌合體。將ES細胞注射到同種動物囊胚腔中后，能夠形成嵌合體（chimera），ES細胞能夠參加嵌合體各個器官包含生殖腺發(fā)育。這是檢驗一個細胞系是否為ES細胞標準。 第45頁3、ES細胞判定- 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)- 核型分析- 堿性磷酸酶（AKP）染色- SSEA-I 免疫熒光標識- 分化能力檢測 體外分化試驗 體內(nèi)分化試驗 嵌合體形成試驗 核移植試驗第46頁 （1）ES細胞形態(tài)學(xué)判定 依ES細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)（胞體體積小，核大、有一個或幾個核仁）和生長特征（呈克隆狀生長，細胞緊密聚集，形似鳥巢，界限不清）對ES細胞進行初步判定。第47頁 （2）核型分析 E

25、S細胞含有正常二倍體核型，可用核型分析進行檢驗第48頁 （3）堿性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在堿性條件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中-磷酸奈酚鈉水解，產(chǎn)生-奈酚，然后再與偶氮鹽偶聯(lián)，形成不溶性染料而展現(xiàn)顏色。步驟：生長胚胎干細胞克隆蓋片以無水乙醇或冷丙酮固定10-15min水洗滴加孵育液室溫5-10min水洗10min復(fù)染（甲基綠等） 10min。結(jié)果：未分化胚胎干細胞顏色以所用偶氮鹽品種而異，分化者則為復(fù)染液顏色。對照：以已建系ES細胞（或小鼠脫帶桑椹胚或囊胚）作為陽性對照，作用液中不含-萘酚磷酸鈉為陰性對照。 第49頁第50頁（4）胚胎干細胞特異表面抗原表示免疫熒光檢測SSEA

26、胚胎階段特異性抗原:SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 Thmoson分離hES 陰性 弱陽性 強陽性Gearhart分離hES 陽性 弱陽性 陽性小鼠ES 陽性 陰性 陰性鼠和人胚胎干細胞表示表面抗原有種屬差異。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Oct-4表示 Oct-4只限定在多潛能細胞中表示。人和小鼠胚胎干細胞都表示轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，當胚胎干細胞分化時，其表示能力大大降低。第51頁52第52頁（5）分化能力檢測體外分化能力觀察:無喂養(yǎng)層和無抑制分化因子條件下培養(yǎng)，胚胎干細胞會分化成各種細胞或發(fā)育成胚胎體：3d “簡單類胚體” 5-10d“囊狀胚體” 貼壁細胞為細胞分化物。第53頁體內(nèi)分化能

27、力觀察：ES細胞接種同一品系小鼠腹股溝（107個細胞）或裸鼠、SCID小鼠（106個細胞）約2周后出現(xiàn)腫塊，4-5周深入增大，摘除腫塊固定切片染色：見三個胚層組織，為畸胎瘤結(jié)構(gòu)裸鼠和SCID小鼠可接種異種細胞和組織移植也可接種腹腔，2-3周后觀察腫瘤第54頁嵌合能力測定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化體小鼠（BALB/c小鼠）或純合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）著床前胚胎內(nèi)，或未起源于白化體小鼠ES注射野灰色小鼠或純合非野灰色小鼠著床前胚胎內(nèi)，再移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，使之發(fā)育成個體。 如ES含有嵌合能力，則會融合到宿主胚胎細胞中，并共同發(fā)育形成各種組織細胞并產(chǎn)生個體小鼠即為嵌合體

28、，其毛色應(yīng)是ES細胞起源品系小鼠和胚胎供體小鼠毛色雜合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。 除毛色觀察，也可檢測同工酶遺傳標識，或采取PCR和小衛(wèi)星DNA方法等判定嵌合體。第55頁六、成體干細胞優(yōu)點獲取相對輕易 源于患者本身成體干細胞在應(yīng)用時不存在組織相容性問題，防止了移植排斥反應(yīng)和使用免疫抑制劑 理論上，成體干細胞致瘤風(fēng)險很低，而且所受倫理學(xué)爭議較少 成體干細胞還含有多向分化潛能 第56頁但胚胎干細胞也存在本身優(yōu)勢： 胚胎干細胞能永生化，能夠傳代建系，且增殖能力強，起源充沛。 即使成體干細胞含有向多系分化能力，但這種分化“效率”尚不理想。經(jīng)過體外擴增培養(yǎng)能提升轉(zhuǎn)化效率，不過體外轉(zhuǎn)化是否會引發(fā)

29、成體干細胞遺傳改變還有待證實，而且這種分化是否是成體干細胞多系分化結(jié)果尚無法必定。成體干細胞和胚胎干細胞各有本身優(yōu)勢和缺點。同時開展對二者研究，能互為裨益，相得益彰。二者研究對干細胞領(lǐng)域而言都是必要。 第57頁成體干細胞判定方法：科學(xué)家還未就成體干細胞判定標準達成一致，經(jīng)常被采取判定方法包含： 利用分子標識在活體組織中對細胞進行標識，然后確定它們所產(chǎn)生特定細胞類型。 將細胞從活體動物上分離出來，在對其進行細胞培養(yǎng)過程中進行標識，之后將細胞移植入另一個動物體內(nèi)，觀察該細胞是否能夠再生其起源組織。 分離細胞，進行細胞培養(yǎng)，并對其分化進行控制，通常采取加入生長因子或向細胞內(nèi)引入新基因方法，進而觀察細

30、胞分化方向。 第58頁 當前研究成體干細胞 （Adult Stem Cells）Bone Marrow Heamatopoietic Stem Cells( HSC )Peripheral Blood Stem Cells ( PBSC )Fetal Liver Stem CellsUmbilical Cord Blood Stem CellsNeural Stem Cells 第59頁造血干細胞作為干細胞研究與應(yīng)用突破口1. 造血細胞是細胞增殖分化最正確模型。2. 造血干祖細胞及各系血細胞表面標志較為清 楚，細胞表型特征可進行定量分析，且可分選。3. 造血干細胞增殖及向各系分化主要誘導(dǎo)因 子

31、、受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、微環(huán)境等原因較為清楚。4. 造血細胞發(fā)揮功效可相對游離，不需“生物支架”、 神經(jīng)、血管、外科移植等復(fù)雜“下游”工藝，因 此便于直接應(yīng)用于臨床。第60頁神經(jīng)干細胞(nural stem cell，NSC) NSC可增殖分化出中樞神經(jīng)系統(tǒng)三種基本細胞：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。 神經(jīng)干細胞生化標識為巢素蛋白及波形蛋白。因為分離神經(jīng)干細胞所需胎兒腦組織較難取材，神經(jīng)干細胞研究仍處于初級階段。 第61頁五、當前干細胞研究熱點人體干細胞建株；干細胞保持不分化培養(yǎng)；干細胞定向誘導(dǎo)分化；干細胞應(yīng)用法律、倫理道德問題；干細胞、組織工程、器官工程；胚胎組織種植及定向誘導(dǎo)分化。第62頁

32、 六、胚胎干細胞研究應(yīng)用前景ES細胞在哺乳動物個體發(fā)生發(fā)育規(guī)律研究中極有價值工具；ES細胞是研究細胞分化理想伎倆；ES細胞是研究基因功效首選細胞；ES細胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物主要路徑之一；ES細胞治療技術(shù)將引發(fā)一場醫(yī)學(xué)革命；ES細胞可用于研究細胞癌變機理和新藥品篩選。第63頁 Human Disease modelHepatocytesBlood Cells藥品開發(fā)、毒性測試臨床醫(yī)療應(yīng)用基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究Human disease model胚胎干細胞基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研發(fā)與臨床應(yīng)用第64頁起源于干細胞組織可能用于治療疾病 細胞類型 治療疾病神經(jīng)細胞 中風(fēng)、帕金森氏病、老年癡呆癥、 脊髓損傷、多發(fā)性硬化病心肌細胞 心臟病發(fā)作、充血性心臟病產(chǎn)生胰島素細胞 糖尿病軟骨細胞 骨性關(guān)節(jié)炎血細胞