大腸桿菌培養(yǎng)感受態(tài)制備質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及鑒定

1、大腸桿菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基配制：（液體培養(yǎng)基）取的燒杯，加入適量的一蒸水（V），稱取胰蛋白胨酵母提取物倒入燒杯中加入磁子攪拌，至完全溶解用調(diào)，定容至分裝后高壓蒸汽滅菌（固體培養(yǎng)基）在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入瓊脂糖：液體培養(yǎng)基一瓊脂糖（用水先溶解）在電爐子上邊加熱邊攪拌至煮沸溶解分裝后高壓滅菌抗生素的加入溫度要求：高壓滅菌后，將融化的固體培養(yǎng)基置與。的水浴中，待培養(yǎng)基溫度降到。時(shí)（手可觸摸）加入抗生素，以免溫度過(guò)高導(dǎo)致抗生素失效，并充分搖勻。注意事項(xiàng)：電爐子溫度不要太高，燒杯直接加熱時(shí)電爐子上要加石棉網(wǎng)高壓滅菌時(shí)，瓶蓋上要插上針頭，防止滅菌時(shí)瓶蓋噴出2定倒平板：培養(yǎng)皿要提前進(jìn)行滅菌、烘干，在超凈工作臺(tái)里

2、，打開酒精燈，在酒精燈的火焰旁進(jìn)行操作，倒完后做好標(biāo)記3定接種（平板劃線分離法）：接種環(huán)挑取大腸桿菌進(jìn)行接種：圖式：注意：每次劃線前接種環(huán)都要灼燒滅菌，再冷卻。4定37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)：接種好的培養(yǎng)皿正置15分鐘，然后倒置放入培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)倒置培養(yǎng)原因：恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸汽的形式蒸發(fā)，倒置培養(yǎng)皿則會(huì)使水蒸汽凝結(jié)成水滴留在蓋上。如果正方，則水分形成的水滴會(huì)落入培養(yǎng)基表面并擴(kuò)散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會(huì)導(dǎo)致菌隨水?dāng)U散，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離目的。大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化感受態(tài)：細(xì)菌處于容易吸收外源的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化：是指質(zhì)粒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。一、

3、制備：步驟從大腸桿菌a的培養(yǎng)平板上挑取一個(gè)單菌落接于液體培養(yǎng)基的試管中，7振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。以1的%接種量將以上過(guò)夜培養(yǎng)物接種于液體培養(yǎng)基中C振蕩培養(yǎng)將菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，冰上放置回收細(xì)胞以便培養(yǎng)液流盡c懸浮沉淀0離心倒出培養(yǎng)液，將管倒置用冰冷的立即放在冰上保溫C,用冰冷的0.1分裝細(xì)胞，每，離心，回收細(xì)胞懸浮細(xì)胞（務(wù)必放冰上）M一份。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。、轉(zhuǎn)化：步驟：在|J新鮮配制的感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒|JWn混勻同時(shí)做以下對(duì)照管（受體菌對(duì)照：JI感受態(tài)細(xì)菌JI無(wú)菌水質(zhì)粒對(duì)照：Ji溶液ja質(zhì)粒）冰上放置將管放到I循環(huán)水浴熱沖擊取出，迅速冰浴每管加J液體培養(yǎng)基，C慢搖復(fù)蘇取J已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞或?qū)?/p>

4、照樣品，各分別涂在含有或不含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中待吸干菌液后，倒置培養(yǎng)皿，于C培養(yǎng)過(guò)夜次日在含氨芐青霉素的培養(yǎng)皿上長(zhǎng)的菌落即為含有質(zhì)粒的大腸桿菌（即轉(zhuǎn)化成功）質(zhì)粒的提取溶液：TOC o 1-5 h z溶液I:葡萄糖、（）、溶液II:、溶液III：醋酸鉀（）：、冰醋酸：5:步驟：在錐形瓶中加入液體培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素挑取單菌落接種于錐形瓶中，培養(yǎng)過(guò)夜次日，取培養(yǎng)物于管中，離心吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥將細(xì)菌沉淀懸浮于溶液I中，充分混勻，室溫放置加溶液11（新鮮配制），蓋緊管皿，輕柔混勻混合物，冰上放置加入預(yù)冷的溶液III,蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置離心，將上清轉(zhuǎn)移至另

5、一管向上清中加入等體積的氯仿（去蛋白），反復(fù)混勻，離心，將上清轉(zhuǎn)移至另一管向上清中加入倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后，室溫放置，離心，倒去上清液，把管倒扣在吸水紙上，吸干液體用乙醇洗滌質(zhì)粒沉淀，震蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥加入緩沖液或無(wú)菌水，溶解，C保存3溶注意事項(xiàng)：在混勻時(shí)，不能劇烈震蕩，動(dòng)作一定要輕柔。氯仿抽提完，轉(zhuǎn)移上清時(shí)，一定不要吸到中間蛋白層，寧少勿多。質(zhì)粒的鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)步驟：1制溶備瓊脂糖凝膠電泳：在錐形瓶中加入X緩沖液，稱取瓊脂糖放入錐形瓶中，置微波爐中，中火加熱至完全熔化，取出搖勻，則為的瓊脂糖凝膠。待瓊脂糖凝膠冷卻至。時(shí)，加入溴化乙錠（）3.取有機(jī)玻璃內(nèi)槽

6、，洗凈晾干，用橡皮膏將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好，一定要封嚴(yán)，放好梳子將冷到0瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）目視凝膠凝固后，再過(guò)半個(gè)小時(shí)，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內(nèi)，加入X緩沖液至電泳槽中，加至液面剛沒(méi)過(guò)膠板約加樣：將（染料）與被測(cè)混合，用移液槍將樣品加入到梳子孔中，對(duì)照滴在最下面的孔電泳：接通電源，調(diào)節(jié)電壓、電流8加觀察結(jié)果：在將膠板放在紫外燈下，連接電腦，拍照。TOC o 1-5 h z氨芐青霉素（）（）溶解氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至m分裝成小份于C貯存。常以的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。羧芐青霉素（）（）溶解羧芐

7、青霉素二鈉鹽于足量的水中，最后定容至。分裝成小份于C貯存。常以的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。甲氧西林（）（）溶解甲氧西林鈉于足量的水中，最后定容至。分裝成小份于C貯存。常以終濃度與氨芐青霉素一起添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基?？敲顾兀ǎǎ┤芙饪敲顾赜谧懔康乃校詈蠖ㄈ葜?。分裝成小份于C貯存。常以的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。氯霉素（）（）溶解氯霉素足量的無(wú)水乙醇中，最后定容至m分裝成小份于C貯存。常以的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。鏈霉素（）（）溶解鏈霉素硫酸鹽于足量的無(wú)水乙醇中，最后定容至。分裝成小份于C貯存。常以的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。萘啶酮酸（中alidix）i（c5magc）/imdl溶解萘啶酮酸鈉鹽于足量的水中，最后定