PCR的定義、歷史與運用

1、 HYPERLINK ./ HYPERLINK ./ 更多資料料請訪問問.HYPERLINK EE:還未拷拷貝企業(yè)管管理管理知知識(htttp:.)(.) HYPERLINK ./ 更多企業(yè)業(yè)學(xué)院： HYPERLINK ./Shop/ ./Shoop/中小企企業(yè)管理理全能版版183套套講座+897700份份資料 HYPERLINK ./Shop/40.shtml ./SShopp/400.shhtmll總經(jīng)理理、高層層管理49套講講座+1163888份資料 HYPERLINK ./Shop/38.shtml ./SShopp/388.shhtmll中層管管理學(xué)院院46套講講座+660200份資

2、料 HYPERLINK ./Shop/39.shtml ./SShopp/399.shhtmll國學(xué)智智慧、易易經(jīng)46套講講座 HYPERLINK ./Shop/41.shtml ./SShopp/411.shhtmll人力資資源學(xué)院院56套講講座+2271223份資料 HYPERLINK ./Shop/44.shtml ./SShopp/444.shhtmll各階段段員工培培訓(xùn)學(xué)院院77套講講座+ 3244份資料 HYPERLINK ./Shop/49.shtml ./SShopp/499.shhtmll員工管管理企業(yè)業(yè)學(xué)院67套講講座+ 87220份資料 HYPERLINK ./Shop/

3、42.shtml ./SShopp/422.shhtmll工廠生生產(chǎn)管理理學(xué)院52套講講座+ 139920份份資料 HYPERLINK ./Shop/43.shtml ./SShopp/433.shhtmll財務(wù)管管理學(xué)院院53套講講座+ 179945份份資料 HYPERLINK ./Shop/45.shtml ./SShopp/455.shhtmll銷售經(jīng)經(jīng)理學(xué)院院56套講講座+ 143350份份資料 HYPERLINK ./Shop/46.shtml ./SShopp/466.shhtmll銷售人人員培訓(xùn)訓(xùn)學(xué)院72套講講座+ 48779份資料 HYPERLINK ./Shop/47.sht

4、ml ./SShopp/477.shhtmll何謂PCCR 簡單單的說，PCRR就是利利用DNNA HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-473.html 聚合合酶對特特定基因因做體外外或 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-952.html 試管管內(nèi)(InVittro)的大大量合成成。基本本上它是是利用DDNA聚聚合酶進進行專一一性的連連鎖復(fù)制制.目前前常用的的技術(shù),可以將將一段基基因復(fù)制制為原來來的一百百億至一一千億倍倍。 PCRR的要素素 基基本的PPCR須須具備.要被被復(fù)制的的DNAA模板(Teempllatee).界定定復(fù)

5、制范范圍兩端端的引物物(Prrimeers).DNNA聚合合酶(Taqq.PPolyymeaarsee)4.合合成的原原料及水水。PCCR反應(yīng)應(yīng)包括三三個主要要步驟，分別是是 1).DDenaaturratiion2).AAnneealiingofpriimerrs,andd3).EExteensiionofpriimerrs。所謂Dennatuurinng乃是是將DNNA加熱熱變性，將雙雙股的DDNA加加熱后轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)為單股股DNAA以做為為復(fù)制的的模板.而AAnneealiing則是令令Prrimeers于于一定的的溫度下下附著于于模板DDNA兩兩端。最后在在DNAA聚合酶酶(ee.g.Taaq

6、-ppolyymerrasee)的的作用下下進行引引物的延延長(Exttenssionnoffprrimeers)及另一一股的合合成。PCR的的歷史 PPCR的的發(fā)展可可以說是是從DNNA合成成酵素的的發(fā)現(xiàn)緣緣起。DDNA合合成酵素素最早于于19555年發(fā)發(fā)現(xiàn)(DNAApoolymmeraaseI),而較較具有實實驗價值值及可得得性的 KleenowwfrragmmenttoffEE.CColii則是是于700年代的的初期由由Dr.H.Kllenoow所所發(fā)現(xiàn),但由由于這個個酵素是是一種易易被熱所所破壞之之酵素,因此此不符合合一連串串的高溫溫連鎖反反應(yīng)所需需。現(xiàn)今今所使用用的酵素素(簡簡稱TT

7、aqpollymeerasse),則是是于19976年年從熱泉泉Hootsspriing中中的細菌菌(ThhermmusAquuatiicuss)分分離出來來的。它的特特性就在在于能耐耐高溫，是一個個很理想想的酵素素，但它它被廣泛泛運用則則于800年代之之后。PPCR的的原始雛雛形概念念是類似似基因修修復(fù)復(fù)制制(DDNAreppairrreepliicattionn)，它它是于119711年由Dr.KjjelllKllepppe提提出。他他發(fā)表第第一個單單純且短短暫性基基因復(fù)制制(類類似PCCR前兩兩個周期期反應(yīng))的實實驗。而現(xiàn)今今所發(fā)展展出來的的PCRR則于119833由DDr.KarryB

8、B.MMulllis發(fā)發(fā)展出的的，Drr.MMulllis當(dāng)當(dāng)年服務(wù)務(wù)于一家家物科技技研究公公司(Perrkinn- EElmeerCCetuusCCorpporaatioon).目前前這家公公司在PPCR的的相關(guān)儀儀器及原原料上占占有很大大的巿場場。Drr.Muulliis并并于19985年年與SSaikki等等人正式式表了第第一篇相相關(guān)的論論文。此此后，PPCR的的運用一一日千里里，相關(guān)關(guān)的論文文發(fā)表質(zhì)質(zhì)量可以以說是令令眾多其其它研究究方法難難望其項項背。在在19989年，SScieencee將PPCR中中的DNNA合成成酵素命命名為當(dāng)當(dāng)年的風(fēng)風(fēng)云分子子(MMoleeculleooftth

9、eyeaar)，而PCCR本身身則列為為年度的的重要科科學(xué)發(fā)明明產(chǎn)物。當(dāng)然，它的原原發(fā)明者者更在往往后獲得得諾貝爾爾的桂冠冠。 影響PPCR的的因素 PPCR是是非常直直接、簡簡單又具具有強大大威力的的技術(shù)。誠如一一位當(dāng)年年參與PPCR誕誕生的資資深研究究員HeenryyErrlicch所言言”在分分子生物物學(xué)的領(lǐng)領(lǐng)域中，只要擁擁有它，你便可可以無照照營業(yè)” (PPCRalllowsspeeopllettoppraccticcemmoleecullarbioologgywwithhouttalisscennce)。也因因此，活活用及慎慎用PCCR是確確保一定定品質(zhì)的的必要條條件。PPCR本本身

10、雖然然是一個個單純的的實驗技技術(shù)，但但是一個個好的PPCR反反應(yīng)及其其產(chǎn)物則則是受到到很多因因素的影影響。這這些因素素色括反反應(yīng)中各各種原料料的濃度度(TTaq.Poolymmeraase,prrimeers,dNNTPss,MMgCll2)，也包包括整個個反應(yīng)中中各步驟驟的溫度度與時間間的設(shè)定定。當(dāng)然然DNAA模板(Temmplaate)與引信(Prrimeers)本身身條件也也占有一一定的重重要性。近來的的觀念中中，共溶溶劑諸如如Diimetthyllsuulfooxidde(DSMMO)、glyycerrol、 FoorammideeanndTTetrrameethyylammmonni

11、ummchhlorridee(TTMACC)也也對整個個反應(yīng)產(chǎn)產(chǎn)生若干干重要的的影響。 PPCR的的運用 PPCR除除了是一一個診斷斷工具外外，更重重要的是是它有廣廣泛的運運用。PPCR本本身可直直接用來來鑒定特特定基因因的存在在與否，也可以以用來偵偵測基因因是否有有異常(Geenemuttatiion,deelettionn,aandreaarraangeemennt)。例如如，在醫(yī)醫(yī)學(xué)上對對遺傳疾疾病或腫腫瘤癌癥癥的診斷斷及預(yù)后后的評估估；對對細菌、病毒及及霉菌感感染的診診斷。它它也可成成為一個個生產(chǎn)線線進而大大量復(fù)制制特定的的基因進進行基因因密碼的的讀取(DNNAssequuenccin

12、gg)及及其它的的運用。舉凡對對生物標(biāo)標(biāo)本及法法醫(yī)學(xué)上上的樣本本鑒定，從單一一毛發(fā)、一只精精蟲或一一滴血液液、唾液液來找出出兇手。也可可以做DDNA指指紋(Finngerrpriintss)比比對幫助助親子關(guān)關(guān)系的鑒鑒定。PPCR更更可以用用于器官官移植組組織兼容容性HLLA的分分析。另另外在演演化上的的分析，經(jīng)由PPCR的的運用也也產(chǎn)生重重大的進進展。近近來，在在生物醫(yī)醫(yī)學(xué)的研研究上，特別是是細胞間間訊息的的傳遞分分子，諸諸如介白白質(zhì)(Intterlleukkinees)及各種種 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-641.html 生長因因子(Groowth

13、hfaactoors)基因因的表現(xiàn)現(xiàn)都可用用 PCCR來進進行質(zhì)與與量的分分析。 PCRR污染及及解決對對策PCCR檢測測微量感感染因子子時，一一定要注注意產(chǎn)物物殘留污污染的問問題。 一污染染的預(yù)防防 進行行PCRR操作時時，操作作人員應(yīng)應(yīng)該嚴(yán)格格遵守一一些操作作規(guī)程，最大程程度地降降低可能能出現(xiàn)的的PCRR污染或或杜絕污污染的出出現(xiàn)。 （一）劃分操操作區(qū)：目前，普通PPCR尚尚不能做做到單人人單管，實現(xiàn)完完全閉管管操作，但無論論是否能能夠達到到單人單單管，均均要求實實驗操作作在三個個不同的的區(qū)域內(nèi)內(nèi)進行，PCRR的前處處理和后后處理要要在不同同的隔離離區(qū)內(nèi)進進行： 1.標(biāo)本處處理區(qū)，包括擴擴

14、增摸板板的制備備； 22.PPCR擴擴增區(qū)，包括反反應(yīng)液的的配制和和PCRR擴增； 3.產(chǎn)物物分析區(qū)區(qū)，凝膠膠電泳分分析，產(chǎn)產(chǎn)物拍照照及重組組克隆的的制備。 各工工作區(qū)要要有一定定的隔離離，操作作器材專專用，要要有一定定的方向向性。如如：標(biāo)本本制備PCRR擴增產(chǎn)物分分析產(chǎn)產(chǎn)物處理理。 切切記：產(chǎn)產(chǎn)物分析析區(qū)的產(chǎn)產(chǎn)物及器器材不要要拿到其其他兩個個工作區(qū)區(qū)。（二）分分裝試劑劑：PCCR擴增增所需要要的試劑劑均應(yīng)在在裝有紫紫外燈的的 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-347.html 超凈工工作臺或或負壓工工作臺配配制和分分裝。所所有的加加樣器和和 HYPERLIN

15、K .ebioe./yp/product-list-925.html 吸頭需固固定放于于其中，不能用用來吸取取擴增后后的DNNA和其其他來源源的DNNA： 1PCRR用水應(yīng)應(yīng)為高壓壓的雙蒸蒸水； 2引物和和dNTTP用高高壓的雙雙蒸水在在無PCCR擴增增產(chǎn)物區(qū)區(qū)配制； 3引物物和dNNTP應(yīng)應(yīng)分裝儲儲存，分分裝時應(yīng)應(yīng)標(biāo)明時時間，以以備發(fā)生生污染時時查找原原因。 (三)實驗驗操作注注意事項項盡盡管擴增增序列的的殘留污污染大部部分是假假陽性反反應(yīng)的原原因，樣樣品間的的交叉污污染也是是原因之之一。因因此，不不僅要在在進行擴擴增反應(yīng)應(yīng)是謹慎慎認真，在樣品品的收集集、抽提提和擴增增的所有有環(huán)節(jié)都都應(yīng)該注

16、注意： 1.戴一次次性手套套，若不不小心濺濺上反應(yīng)應(yīng)液，立立即更換換手套； 2.使用用一次性性 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-925.html 吸頭，嚴(yán)嚴(yán)禁與PPCR 產(chǎn)物分分析室的的吸頭混混用，吸吸頭不要要長時間間暴露于于空氣中中，避免免氣溶膠膠的污染染； 33.避避免反應(yīng)應(yīng)液飛濺濺，打開開 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-958.html 反應(yīng)管管時為避避免此種種情況，開蓋前前稍離心心收集液液體于管管底。若若不小心心濺到手手套或桌桌面上，應(yīng)立刻刻更換手手套并用用稀酸擦擦拭桌面面； 44.操操作多份份樣品時時，制備備反

17、應(yīng)混混合液，先將ddNTPP、緩沖沖液、引引物和酶酶混合好好，然后后分裝，這樣即即可以減減少操作作，避免免污染，又可以以增加反反應(yīng)的精精確度； 5.最后后加入反反應(yīng)模板板，加入入后蓋緊緊 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-958.html 反應(yīng)管管； 6.操作作時設(shè)立立陰陽性性對照和和空白對對照，即即可驗證證PCRR反應(yīng)的的可靠性性，又可可以協(xié)助助判斷擴擴增系統(tǒng)統(tǒng)的可信信性； 7.盡可能能用可替替換或可可高壓處處理的加加樣器，由于加加樣器最最容易受受產(chǎn)物氣氣溶膠或或標(biāo)本DDNA的的污染，最好使使用可替替換或高高壓處理理的加樣樣器。如如沒有這這種特殊殊的加樣樣器

18、，至至少PCCR操作作過程中中加樣器器應(yīng)該專專用，不不能交叉叉使用，尤其是是PCRR產(chǎn)物分分析所用用加樣器器不能拿拿到其它它兩個區(qū)區(qū)； 88.重重復(fù)實驗驗，驗證證結(jié)果，慎下結(jié)結(jié)論。 二追蹤污污染源 如果不不慎發(fā)生生污染情情況，應(yīng)應(yīng)從下面面幾條出出發(fā)，逐逐一分析析，排除除污染。 （一一）設(shè)立立陰陽性性對照：有利于于監(jiān)測反反應(yīng)體系系各成分分的污染染情況。選擇陽陽性對照照時，應(yīng)應(yīng)選擇擴擴增弱，且重復(fù)復(fù)性好的的樣品，因強陽陽性對照照可產(chǎn)生生大量不不必要的的擴增序序列，反反而可能能成為潛潛在的污污染源。如果以以含靶序序列的重重組質(zhì)粒粒為對照照，1000個拷拷貝之內(nèi)內(nèi)的靶序序列就足足以產(chǎn)生生陽性擴擴增。陰

19、陰性對照照的選擇擇亦要慎慎重，因因為PCCR敏感感性極高高，可以以從其它它方法（Souurthhernn印跡跡或點雜雜交等）檢測陰陰性的標(biāo)標(biāo)本中檢檢測出極極微量的的靶分子子。此外外，每次次擴增均均應(yīng)包括括PCRR體系中中各試劑劑的時機機對照，即包括括PCRR反應(yīng)所所需的全全部成分分，而不不加模板板DNAA，這對對監(jiān)測試試劑中PPCR產(chǎn)產(chǎn)物殘留留污染是是非常有有益的。如果擴擴增結(jié)果果中試劑劑對照為為陽性結(jié)結(jié)果，就就是某一一種或數(shù)數(shù)種試劑劑被污染染了。此此時，要要全部更更換一批批新的試試劑進行行擴增，擴增時時設(shè)立不不同的反反應(yīng)管，每一管管含有一一種被檢檢測試劑劑，在檢檢出污染染試劑后后，應(yīng)馬馬上處

20、理理。 （二）環(huán)環(huán)境污染染：在排排除試劑劑污染的的可能性性外，更更換試劑劑后，若若不久又又發(fā)現(xiàn)試試劑被污污染了，如果預(yù)預(yù)防措施施比較嚴(yán)嚴(yán)密，則則考慮可可能為環(huán)環(huán)境污染染。 環(huán)境境污染中中常見的的污染源源主要有有： 11.模模板提取取時真空空抽干裝裝置； 2.凝膠電電泳加樣樣器； 3.電泳裝裝置； 4.紫外分分析儀； 5.切膠膠用刀或或手術(shù)刀刀片； 6. HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-47.html 離心機機； 7.冰箱箱門把手手，冷凍凍架，門門把手或或?qū)嶒炁_臺面等； 此時時可用擦擦拭實驗驗來查找找可疑污污染源。1）用用無菌水水浸泡過過的滅菌菌棉簽擦擦拭可疑

21、疑污染源源；2）0.11ml去去離子水水浸泡；3）取取5mll做PCCR實驗驗；4）電泳檢檢測結(jié)果果。 88.氣氣溶膠。如果經(jīng)經(jīng)過上述述追蹤實實驗，仍仍不能查查找到確確切污染染源，則則污染可可能是由由空氣中中PCRR 產(chǎn)物物的氣溶溶膠造成成的，此此時就應(yīng)應(yīng)該更換換實驗場場所，若若條件不不允許，則重新新設(shè)計新新的引物物（與原原引物無無相關(guān)性性）。 三污污染處理理 （一一）環(huán)境境污染 1.稀酸處處理法：對可疑疑器具用用1mool/LL鹽酸擦擦拭或浸浸泡，使使殘余DDNA脫脫嘌呤； 2.紫外外照射（UV）法：紫紫外波長長（nmm）一般般選擇2254/3000nm，照射330miin即可可。需要要注意

22、的的是，選選擇UVV作為消消除殘留留PCRR產(chǎn)物污污染時，要考慮慮PCRR產(chǎn)物的的長度與與產(chǎn)物序序列中堿堿基的分分布，UUV照射射僅對5500bbp以上上長片段段有效，對短片片段效果果不大。UV照照射時，PCRR產(chǎn)物中中嘧啶堿堿基會形形成二聚聚體，這這些二聚聚體可使使延伸終終止，但但并不是是DNAA 鏈中中所有嘧嘧啶均能能形成二二聚體，且UVV照射還還可使二二聚體斷斷裂。形形成二聚聚體的程程度取決決于UVV波長，嘧啶二二聚體的的類型及及與二聚聚體位點點相鄰 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-674.html 核核苷酸的的序列。在受照照射的長長DNAA鏈上，形成

23、二二聚體缺缺陷的數(shù)數(shù)量少于于0.0065/堿基，其他非非二聚體體的光照照損傷（如環(huán)丁丁烷型嘧嘧啶復(fù)合合體，胸胸腺嘧啶啶乙二醇醇，DNNA鏈間間與鏈內(nèi)內(nèi)的交聯(lián)聯(lián)和 DDNA斷斷裂等）均可終終止TaaqDDNA聚聚合酶的的延伸。這些位位點的數(shù)數(shù)量與二二聚體位位點相當(dāng)當(dāng)。如果果這些位位點（00.133/堿基基）在DDNA分分子上隨隨機分布布，一個個 5000bpp片段的的DNAA分子鏈鏈上將有有32處處損傷位位點，那那么，1105個個這樣的的分子中中每個分分子中會會至少有有一處損損傷。相相反，如如果1000bpp的片段段，每條條鏈上僅僅有 66處損傷傷，1005個拷拷貝分子子中將有有許多分分子沒有有

24、任何損損傷。這這就是UUV照射射有一定定的片段段長度限限制的原原因。（二）反反應(yīng)液污污染 可可采用下下列方法法之一處處理： 1.DNaaseI法：PCRR混合液液（未加加模板和和Taqq聚合酶酶）加入入0.55UDDNasseII，室溫溫反應(yīng)330mmin后后加熱滅滅活，然然后加入入模板和和Taqq聚合酶酶進行正正常PCCR擴增增。該方方法的優(yōu)優(yōu)點是不不需要知知道污染染DNAA的序列列； 22.內(nèi)內(nèi)切酶法法：選擇擇識別44個堿基基的內(nèi)切切酶（如如MsppI和和TaqqI等等），可可同時選選擇幾種種，以克克服用一一種酶只只能識別別特定序序列的缺缺陷，室室溫作用用1h后加熱熱滅活進進行PCCR；

25、3.紫外照照射法：未加模模板和TTaq聚聚合酶的的PCRR混合液液進行紫紫外照射射，注意意事項與與方法同同上述UUV照射射法； 4.g射線線輻射法法：1.5kGGy的輻輻射可完完全破壞壞0.11ng基基因組DDNA，2.00kGGy可破破壞1004拷貝貝的質(zhì)粒粒分子，4.00kGGy仍不不影響PPCR，但高于于此限度度會使PPCR擴擴增效率率下降。引物可可受照射射而不影影響PCCR，gg射線是是通過水水的離子子化產(chǎn)生生自由基基來破壞壞DNAA的。（三）尿尿嘧啶糖糖苷酶（UNGG）法 由于UUV照射射的去污污染作用用對5000bpp以下的的片段效效果不好好，而臨臨床用于于檢測的的PCRR擴增片片

26、段通常常為 3300bbp左右右，因此此UNGG的預(yù)防防作用日日益受到到重視和和肯定。 1.原理理：在PPCR產(chǎn)產(chǎn)物或引引物中用用dU代替ddT。這這種dUU化的PPCR產(chǎn)產(chǎn)物與 UNGG一起孵孵育，因因UDGG可裂解解尿嘧啶啶堿基和和糖磷酸酸骨架間間的N-糖基鍵鍵，可除除去dUU而阻止止TaqqDNAA聚合酶酶的延伸伸，從而而失去被被再擴增增的能力力。UNNG對不不含dUU的模板板無任何何影響。UNGG可從單單或雙鏈鏈DNAA中消除除尿嘧啶啶，而對對RNAA中的尿尿嘧啶和和單一尿尿嘧啶分分子則無無任何作作用。 2.dUTTP法：用 ddUTPP代替ddTTPP，使產(chǎn)產(chǎn)物中摻摻入大量量dU。在

27、再次次進行PPCR擴擴增前，用UNNG處理理PCRR混合液液即可消消除PCCR產(chǎn)物物的殘留留污染。由于UUNG在在PCRR循環(huán)中中的變性性一步便便可被滅滅活，因因此不會會影響含含dU的的新的PPCR產(chǎn)產(chǎn)物。 3.dU引引物法：合成引引物時以以dU代dTT，這樣樣PCRR產(chǎn)物中中僅5端帶 dU。UNGG處理后后，引物物失去了了結(jié)合位位點而不不能擴增增。對長長片段（1-22kb以以上）的的擴增用用dUTTP法效效率較用用dTTTP低，而用ddU法就就可克服服這一缺缺點。 dU引引物最好好將dUU設(shè)計在在3端或近近端。該該法僅能能用于引引物以外外試劑的的處理。 4.優(yōu)點點：可以以去除任任何來源源的污

28、染染；UNNG處理理可以和和PCRR擴增在在同一個個反應(yīng)管管內(nèi)進行行；由于于擴增產(chǎn)產(chǎn)物中有有大量ddU存在在，可徹徹底消除除污染源源。 55.需需注意的的是摻入入dUTTP的DDNA不不應(yīng)對產(chǎn)產(chǎn)物的任任何操作作有影響響，在進進行PCCR產(chǎn)物物克隆時時，應(yīng)該該轉(zhuǎn)化UUNG-（UNNG缺陷陷）大腸腸桿菌受受體菌，否則轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物物會被受受體菌UUNG消消化掉。 （四四）固固相捕獲獲法 用用于去除除標(biāo)本中中污染的的核酸和和雜質(zhì)，原理如如下：11）用一一生物素素標(biāo)記的的單鏈RRNA探探針與待待擴核酸酸雜交，雜交區(qū)區(qū)域是非非擴增區(qū)區(qū)；2）用包被被鏈霉親親和素的的固相載載體來捕捕獲帶有有生物素素探針的的雜交

29、核核酸，通通過漂洗洗可去除除污染的的擴增產(chǎn)產(chǎn)物和雜雜質(zhì)；33）洗脫脫靶分子子后用特特異引物物擴增非非RNAA探針雜雜交區(qū)域域。第22）步的的漂洗后后可用PPCR檢檢測以確確定標(biāo)本本是否被被擴增產(chǎn)產(chǎn)物或重重組質(zhì)粒粒污染。 （五五）RSS-PCCR法（RNAA-sppeciificcPCCR） 也稱為為鏈特異異性PCCR，主主要指用用于 RRNA模模板的特特異性PPCR法法，該法法可明顯顯降低假假陽性而而不影響響PCRR的敏感感性。其其關(guān)鍵在在于設(shè)計計引物，逆轉(zhuǎn)錄錄引物的的3端（AA區(qū)）有有200個 HYPERLINK .ebioe./yp/product-list-674.html 核苷苷酸左右

30、右為模板板的特異異性互不不序列，5端20個核核苷酸（C區(qū)）為附加加修飾堿堿基。與與mRNNA逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速速離心使使cDDNA與與多余引引物分開開，再用用和第二二引物（C）以以第一鏈鏈cDNNA為模模板合成成第二鏈鏈cDNNA，以以后的PPCR循循環(huán)中用用逆轉(zhuǎn)錄錄引物的的B區(qū)和和引物CC進行擴擴增加尾尾cDNNA，而而污染的的DNAA或質(zhì)粒粒DNAA才不會會被擴增增。 （六）抗抗污染引引物法 該對引引物擴增增時通過過病毒DDNA克克隆如入入質(zhì)粒的的位點。這一區(qū)區(qū)域只存存在完整整的原病病毒中，在重組組質(zhì)粒中中，這一一區(qū)域分分成兩個個區(qū)域與與克隆位位點被。如果重重組質(zhì)粒粒污染了了標(biāo)本，也不能能

31、擴增出出任何條條帶，即即使出現(xiàn)現(xiàn)了擴增增帶，其其大小也也與預(yù)期期的不同同。只有有原病毒毒DNAA才能被被引物擴擴增，因因此只要要出現(xiàn)預(yù)預(yù)期大小小的擴增增帶就可可以證明明標(biāo)本是是陽性的的，該法法試用于于環(huán)狀靶靶分子系系列。 四其其它PCCR檢測測方法： （一一）兩兩步法：是指在在用套式式 PCCR方法法擴增某某些含量量低微的的標(biāo)本時時，兩對對引物在在同一個個管中以以簡化步步驟，減減少污染染。通常常第一步步進行220-225個循循環(huán)，擴擴增外引引物片段段；第二二步再進進行100個循環(huán)環(huán)，擴增增內(nèi)引物物片段。兩步法法對內(nèi)外外引物的的Tm值值有特殊殊要求，即內(nèi)外外引物的的退火溫溫度高（如688），在在

32、此溫度度下內(nèi)引引物不與與模板退退火，然然后降低低退火溫溫度（至至 555）再擴擴增內(nèi)引引物片段段，這樣樣，在操操作過程程中，僅僅打開PPCR反反應(yīng)管一一次，大大大減少少了污染染的可能能性。（二）熒光法法：亦稱稱熒光PPCR技技術(shù)（ffluooressenccePCRR,FF-PCCR），是19995年年由美國國PE公公司首先先研制成成功的，它融匯匯了 PPCR的的靈敏性性、DNNA雜交交的特異異性和光光譜技術(shù)術(shù)精確定定量的優(yōu)優(yōu)點，電電腦同步步跟蹤，數(shù)據(jù)自自動化處處理，直直接探測測PCRR過程中中的變化化以獲得得定量的的結(jié)果，不需要要做 PPCR后后處理或或檢測，完全閉閉管操作作。探針針標(biāo)記除除用TEET和FFAM外外，還可可用HEEX、JJ