微生物生理生化第二單元第四講-2018

1、2018年春季高級(jí)微生物生理生化第二單元：遺傳信息傳遞與組穩(wěn)定性第四講：轉(zhuǎn)錄及RNA提綱RNA及其結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄細(xì)菌轉(zhuǎn)錄真核生物轉(zhuǎn)錄mRNA前體的修飾RNA剪切古菌轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄與DNA拓?fù)鋵W(xué)非編碼RNA小RNACRISPRRNARNA化學(xué)核糖核苷酸（ribonucleotides）GAUCRNA折疊RNA單鏈可以折疊成三維結(jié)構(gòu) 有些具有結(jié)構(gòu)的RNA催化活性RNA折疊細(xì)菌轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶（7000分子/大腸桿菌細(xì)胞）酶：2行進(jìn)性（prosivity）酶組裝因子：特異性（specificity）和其他因子：在不同情況下，采用不同因子，調(diào)控不同酶+ 因子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄 全酶：啟動(dòng)子中心位于-35, -10位點(diǎn)的二個(gè)

2、6 bp序列，加上起始位點(diǎn)RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子多順反子（子） 5-UTR (untranslated region)，SD (ShineDalgarno)序列細(xì)菌轉(zhuǎn)錄起始和延伸形成閉合復(fù)合物：RNAP識(shí)別啟動(dòng)子，DNA呈雙螺旋形式形成開放復(fù)合物：啟動(dòng)子區(qū)雙鏈打開，模板鏈進(jìn)入和之間孔道性起始：短的無效RNA啟動(dòng)子脫離、解離：RNAP后解離10-nt RNA后，離開啟動(dòng)子，延伸：酶繼續(xù)轉(zhuǎn)錄（5-3），40-50 nt/秒（大腸桿菌）終止Rho依賴型終止（少）： Rho識(shí)別RNA序列，沿RNA滑動(dòng)，解離RNA和RNA聚合酶Rho不依賴型終止：RNA上的發(fā)卡結(jié)構(gòu)接一串U，AU配對(duì)弱轉(zhuǎn)錄調(diào)控：表達(dá)的調(diào)

3、控通常在轉(zhuǎn)錄起始步驟轉(zhuǎn)錄因子（350個(gè)/大腸桿菌）：激活因子、抑制因子作用方式真核生物轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶：三類，均含10個(gè)亞基RNA聚合酶I：5.8S、18S、28S rRNARNA聚合酶II：mRNARNA聚合酶III：tRNAs、5S rRNARNA聚合酶II：像細(xì)菌RNA聚合酶，但更大（12個(gè)亞基）基本轉(zhuǎn)錄因子（general transcription factors） RNA聚合酶II啟動(dòng)子單順反子：mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾真核生物轉(zhuǎn)錄（RNA聚合酶 II）起始：基本轉(zhuǎn)錄因子幫助RNAP II結(jié)合啟動(dòng)子，打開RNAP IIA框，引起DNA彎折（bending）雙鏈，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，TFIID（含

4、TBP亞基）結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄因子（TFIIB, E, F, H）以及RNAP II結(jié)合啟動(dòng)子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物TFIIH中的DNA解旋酶亞基打開雙鏈，使RNAP II得以結(jié)合模板鏈性起始：幾輪10 nt短產(chǎn)物的TFIIH中的蛋白激酶磷酸化RNAP II的C端尾巴，RNAP II構(gòu)象變化，然后脫離基本轉(zhuǎn)錄因子，離開啟動(dòng)子，進(jìn)入延伸模式體內(nèi)轉(zhuǎn)錄起始需求：激活因子結(jié)合增強(qiáng)子，中介因子幫助溝通激活因子和RNAP II，染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物染色質(zhì)中DNA。真核生物轉(zhuǎn)錄（RNA聚合酶 II）延伸或快或慢一系列延伸因子幫助RNAP II避免提前解離染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物處理染色質(zhì)結(jié)構(gòu)問題加工蛋白結(jié)合新生RNA（pre-

5、mRNA）鏈加工：延伸過程中發(fā)生，加工蛋白結(jié)合在RNAP II的C端尾巴上5端加帽：5端以5-5方式加上一個(gè)甲基化的G（僅RNAP II產(chǎn)物有），影響翻譯起始、mRNA穩(wěn)定性內(nèi)含子移除：RNA剪切（splicing）3端加工（切割及poly-A尾巴）：新生鏈在特異位點(diǎn)被切割，200-nt長的poly-A被加上，影響出核轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA穩(wěn)定性、翻譯終止當(dāng)RNA的3端切割發(fā)生后，RNAP II繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生5端不戴帽的 RNA，該RNA的降解促使RNAP II解離、轉(zhuǎn)錄終止RNA剪切rons）與外顯子（exons）內(nèi)含子（外顯子：編碼序列，長度較均一、較短（150 nt）內(nèi)含子：非編碼序列，長度變化

6、大（10100,000 nt）RNA切割識(shí)別位點(diǎn)：5剪切位點(diǎn)，3剪切位點(diǎn)，分叉點(diǎn)兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，中間產(chǎn)物形似“套索（lariat）”剪切體（spliceosome）：含RNA和蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)捕RNA獲、切割、Small nuclear RNAs (snRNAs)：U1, U2, U4, U5, U6，識(shí)別序列，催化切割Small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs)：snRNAs與蛋白質(zhì)結(jié)合而成，剪切體的復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的分子機(jī)器：隨著反應(yīng)進(jìn)行，發(fā)生亞基進(jìn)出變化（體外），或?yàn)橐粋€(gè)包含所有成員的松散整體（體內(nèi)）古菌轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶僅含一類RNA聚合酶，與真核生物RNA聚合

7、酶II相似（11或12個(gè)亞基）啟動(dòng)子：類似真核生物啟動(dòng)子6-8 bpA框：在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游18-27 nt處，TBP識(shí)別B識(shí)別元素（BRE）：在A上游，TFB識(shí)別起始元素序列：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始：TBP結(jié)合轉(zhuǎn)錄A、TFB結(jié)合BRE后，RNAP結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄終止：反向重復(fù)序列后接AT富含區(qū)或者幾段T區(qū)，無RhomRNA結(jié)構(gòu)多樣性多順反子及單順反子多數(shù)沒有5-UTR：無頭（leaderless）mRNA無3端poly-A尾巴轉(zhuǎn)錄與DNA拓?fù)鋵W(xué)孿生超螺旋域（The twin-supercoiled）模型RNAP轉(zhuǎn)錄DNA時(shí)，因?yàn)樾D(zhuǎn)擴(kuò)散極慢，在它前面產(chǎn)生正超螺旋區(qū)域，后面產(chǎn)生負(fù)超螺旋區(qū)域正負(fù)超螺

8、旋區(qū)域成為拓?fù)洚悩?gòu)酶底物DNA分子特定區(qū)域的超螺旋程度取決于那里的轉(zhuǎn)錄水平在真核生物中，幫助前端核小體DNA解纏繞（unwrap）孿生超螺旋域模型非編碼RNA與表達(dá)調(diào)控非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）：不編碼蛋白質(zhì)的RNAtRNA、rRNA、snRNA小RNA（small RNA，sRNA）：40-400 nt，調(diào)控表達(dá)小RNA的種類、活性和機(jī)制反義小RNA（anti-sense RNA）：轉(zhuǎn)錄自特定的非模板鏈；反式小RNA（trans-sRNA）：轉(zhuǎn)錄自非編碼區(qū)，與靶RNA配對(duì)區(qū)短（511 nt），需要RNA分子伴侶幫助通過與靶RNA堿基配對(duì)發(fā)揮作用翻譯抑制/激活、RN

9、A降解/保護(hù)小RNA調(diào)控翻譯及RNA降解No degradationDegradationCRISPRCRISPR（Clustered regularlyerspersed short palindromic repeat）存在于90%的已古菌和70%的已細(xì)菌基于RNA的免疫系統(tǒng)：應(yīng)對(duì)以及其他外來DNA含短重復(fù)序列（repeats）和間隔序列（spacers），間隔序列（2570bp）來自于先前接觸過的作用機(jī)制DNA或其他外源DNA獲取DN段，整合至CRISPR位點(diǎn)，新獲得的靠5端，每個(gè)CRISPR位點(diǎn)可以包含幾百個(gè)repeatsCRISPR位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄出長RNA分子，再加工成短的crRNA（30 nt）crRNA結(jié)合Cas（CRISPR-asso DNA序列，介導(dǎo)核酸酶降解之ted）蛋白，尋找的互補(bǔ)應(yīng)用編輯利用無催化活性Cas9突變體與激活/抑制因子融合蛋白調(diào)控任一的表達(dá)大腸桿菌因子細(xì)菌RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合細(xì)菌轉(zhuǎn)錄過程激活因子/抑制因子作用方式真核生物RNA聚合酶II啟動(dòng)子BRE: TFIIB Recognition Element I