教案開題報告

1、課題來源課題來源選題依據(jù)和背景情況近年來，海洋環(huán)境 嚴重污染，水體富營養(yǎng)化程度日趨嚴重，有害赤潮在 赤潮產(chǎn)生的藻毒素成為污染海水養(yǎng)殖環(huán)境的新要素，嚴重 水產(chǎn)品食用安全（周名江等，2007。 甲藻赤潮所占比例和通過食物鏈傳遞導致高營養(yǎng)級生物以及人類 ，嚴重的可致 。由 甲藻康也形成了潛在的 。氮雜螺環(huán)酸(iracid,)是一類由環(huán)胺藻屬(Azadiium)和 hidoma languida藻產(chǎn)生的脂溶性聚醚類生物毒素其 癥狀與腹瀉性貝毒 S ish ning, )引起的 癥狀非常相似，表現(xiàn)為 、 、嚴重腹瀉和胃腸部痙攣等癥狀。 甲藻亞胺毒（s,M是一組具有環(huán)狀亞胺醚或聚醚大環(huán)結(jié)（含有螺環(huán)中心的海

2、洋脂溶性貝類毒素屬于環(huán)胺類毒素（Cyclic Imies, CIs是一種“快速作用毒素。目前，在我國尚未關于A 與M的 ，但二者的產(chǎn)毒藻在我國海域都有分布et al., 2013; ang t l, 2017，并且在多個沿海城市的貝類中檢測出 A 或 M故而不能完全排除我國將來受到這兩種毒素危害的可能因此研究與 M 進入食物鏈后的生物轉(zhuǎn)化機制對于開發(fā)解毒劑和快速脫毒技術具有重要的科學意義。課題研究目的及理論意義本課題旨在通過模擬貝類濾食AZA產(chǎn)毒藻腹孔環(huán)胺（Azadiniumpoporum）和GYM 產(chǎn)毒藻鞍狀凱倫藻（Kareniaselliformis）的過程，使用LC-MS/MS 方法測定

3、毒素在貝類體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，以期闡釋AZA 與GYM 在貝類體內(nèi)的代實際應用實際應用價值AZAGYM在貝類體內(nèi)的代謝輪廓及毒素與代謝產(chǎn)物對貝類的毒性據(jù)統(tǒng)計，海據(jù)統(tǒng)計，海洋中可以產(chǎn)生毒素的藻類約有 90 種，其中甲藻約 70 種，但是隨著對赤潮藻的深入研究以及技術的不斷發(fā)展， 藻類的數(shù)目很有可能繼續(xù)增加，同時 藻產(chǎn)生的毒素以及其它海洋生物毒素已經(jīng)成為水產(chǎn)品中重要的污染6組：大田軟海綿酸毒素組(okadaiccid,OA)、 毒素PTXYTX（azaspiracid, AZA、環(huán)亞胺類毒素（cyclic imines, CIs）和短 甲藻毒素組 B（/I/W, 20041. 氮雜螺環(huán)酸(Azas

4、piracidAZA 是近幾年來在歐洲發(fā)現(xiàn)的一類新型聚醚類生物毒素，1995 年在愛爾蘭 Killary 海灣的紫貽貝中首次被檢測到（McMahon and Silke, 1996; Satake et al., 199840個碳原子 ，分子中有 20 9 個環(huán)，具有獨特的 6,5,6-三螺環(huán)和環(huán)胺結(jié)構(gòu)，化學結(jié)構(gòu)見圖 1，屬于氨代螺旋酸類貝類毒素（Satake et al., 1998。目前已經(jīng)確定產(chǎn) AZA 藻類主要有 Azadinium. spinosum，Azadinium.poporumAzadinium.obesum。隨著 研究的深入，AZA的分布范圍不斷擴大，在 西海岸、 、亞洲以

5、及南美等地區(qū)都有分布。 AZAAZAAZA1AZA3后的生物轉(zhuǎn)化過程與機體免疫系統(tǒng)AZA 毒素的解毒機制具有重要意義。1 氮雜螺環(huán)酸毒素（AZA）1.0mol/L 150 min 后其毒性沒有明顯變化，在冷藏條件下可長期 。由此看來，AZA 毒素是一類化學性質(zhì)相對穩(wěn)定的化合物。AZA 引起的臨床DSP引起的acidOA)組，初步確定了貝類毒素急性致毒的參考劑量(reference dose，RfD)，其中 AZA1的RfD0.04g/kg(OA的RfD0.33 g/kg貝組織Toyofuku,2006)。AZA1、AZA2AZA3對小鼠腹腔注射致死劑 1999 2011 具 （Michaele

6、tal.,2008。研究發(fā)現(xiàn)，AZA點，使得 肌動蛋白發(fā)生重排，從而改變細胞骨架（李愛峰等2008。還有研AZA的毒性效應與其化學結(jié)構(gòu)有關，不同衍生物引起的效應差別較大（Alfonso et al., 2006甲藻亞胺毒素（Gymnodimines,1994年，從新西蘭FoveauxStrait 的牡蠣（Tiostreachilensis）中首次分離發(fā)現(xiàn)了GYM(Sekiet al., 1995)。GYM是螺旋形的環(huán)亞胺結(jié)構(gòu)，屬于CIs毒素組。亞胺是GYM的毒理功能 ，具有很高的致毒性，屬于“快速作用毒素（Fastacting toxins，T，化學結(jié)構(gòu)如圖2 所示。目前已發(fā)現(xiàn)了5 種結(jié)構(gòu)（

7、et 200320022GYM2GYM研究表明 GYM 對 和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的 乙酰膽堿受體（nicotinic mAChRs）有抑制作用（Mundayetal.,2008）GYM-A 與海蝸牛（Aplysia californica）乙酰膽堿結(jié)合蛋白（acetylcholine-bindingprotein,AChBP）復合物的 AChGYM 與該五聚體蛋白具有高度3GYM-A 與海蝸牛（Aplysiacalifornica）乙酰膽堿結(jié)合蛋白（acetylcholine-bindingprotein,AChBP）復合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)俯視圖（左）和側(cè)視圖（右），GYM-A（綠色球體）Aplys

8、iaAChBP表面GYM 的毒性根據(jù)小鼠生物測定結(jié)果，無論選擇哪種施用途徑（例如，腹腔注射，管飼或喂食施用），CIs中最小的一種。GYM-A 對雌性瑞8096 g /kg b.w.。GYM-A GYM-B 10 80 800 g/kg （Kharratet（Kharratetal.,2008）。而腦室注射半致死劑量為3g/kgb.w.，毒性是腹腔注射的近30 倍（Takadaetal.,2001）。這表明GYM-A 首先影響嚙齒動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進一步突出了高濃度的CIs 在貝類中積累時對人類健康可能存在的風險。 GYM-A 和 GYM-B 注射15 min 內(nèi)出現(xiàn)急性剖無異常。亞致死劑量出現(xiàn)

9、虛脫和呼吸窘迫癥狀，30min 內(nèi)恢復正常，在隨后的 21天觀察期未見異常（Mundayetal.,2004）。小鼠通過灌胃法口服GYM-A 的半致死劑量是腹腔注射的8 倍( 755 g/kg b.w.) 。而以食物添加的方式給藥在濃度高達 7 500 g /kg（Munday et al., 2004）時，沒有重量的變化。目前，尚未有人因食用 GYM 染毒貝亞胺毒素作用具有一定的不可逆性如果長期積累，同樣可能產(chǎn)生神經(jīng)毒性甚Alfonso A, Vieytes M R, Ofuji K, et al. Azaspiracids modulate racellular pH levels in

10、human lymphocytes J. Biochemical and biophysical research communications, 2006, 346(3): 1091-1099.er ernmental Oceanographic Commis of UNESCO/World Health anization), Report of the Jo , 2004R.GuAlfonso A, Vieytes M R, Ofuji K, et al. Azaspiracids modulate racellular pH levels in human lymphocytes J.

11、 Biochemical and biophysical research communications, 2006, 346(3): 1091-1099.er ernmental Oceanographic Commis of UNESCO/World Health anization), Report of the Jo , 2004R.GuH,LuoZ,KrockB,etal.Morphology,phylogenyandazaspiracidprofileofAzadiniumpoporum (Dinophyceae) from theJ. Harmful Algae, 2013, 2

12、1: 64-75.JiangT,LiuL,LiY,etal.Occurrenceofmarinealgaltoxinsinoysterandphytopl tons lesin Daya Bay, SouthJ. Chemosphere, 2017, 183: 80-88.Kharrat R, Servent D, Girard E, et al. The marine phycotoxin gymnodimine s muscular and neuronalnicotinicacetylcholinereceptorsubtypeswithhighaffinityJ.Journalofne

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22、, 郭萌萌, 譚志軍, 等. 環(huán)亞胺毒素研究進展J. 中國漁業(yè)質(zhì)量與標準, 2012, 2(3): 周名江, 于仁成有害赤潮的形成機制、危害效應與防治對策J所閱文獻的查閱范圍通過學校 館典藏 及專業(yè) 等查閱相關知識，通過導師介紹書籍進行閱讀，通過 中文以及外文文獻進行閱讀學習，包括：中國知網(wǎng)、 Elsevier期刊、谷歌學術、萬方 庫、EnvironmentalScience&TechnologyEnvironmental Forensics 等。1本課題通過在 內(nèi)大體積培養(yǎng)含有 1本課題通過在 內(nèi)大體積培養(yǎng)含有 AZA2 GYMA 的產(chǎn)毒藻，通過AZAGYM在AZA在 內(nèi)，以產(chǎn)生 AZA2A

23、ZFC22作為餌料，用于喂養(yǎng)扇LC-MS/MSAZA毒素及其代AZA 在不同貝類體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程及代謝物的變化情況和產(chǎn)生速率。同時 貝類樣品，監(jiān)測扇貝、貽貝 （ROS（SOD（CT（GPX）AZA通過已完成的實驗發(fā)現(xiàn)，AZA2 在扇貝與貽貝體內(nèi)具有不同的代謝途徑，AZA2 的新型代謝產(chǎn)物AZA-886。通過在 內(nèi)進行為期 15 天的扇貝濾食 AZFC22 模擬實驗重復驗證其存在并通過 HR-MS 和 NMRHPLCGYM內(nèi)，以產(chǎn)生 GYMA 和痕量 GYMB 的鞍狀凱倫藻（Karenia 扇貝、貽貝體內(nèi)GYM毒素及其代謝物的含量，探討GYM 在不同貝類體內(nèi)的（ROS（SOD（CT酶活性的變化，探

24、討GYM 毒素積累過程中機體抗氧化系統(tǒng)的響應。擬解決22（AZFC22selliformis）以及無毒球等鞭金藻（I.gal 3011；毒素的測定：使用甲醇提取毒素，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)新型代謝產(chǎn)物AZA-886HR-MS 和 NMR HPLC 技術對新型AZAAZAGYM的室內(nèi)培養(yǎng)方法以 多年培養(yǎng)的可產(chǎn)生 AZA2 的腹孔環(huán)胺藻（AZFC22）GYM3-5 天（不喂食F/2 20L 的光照反應器中大批量培養(yǎng)產(chǎn)毒 貝類的培養(yǎng)及樣品產(chǎn)毒甲藻。選擇60 只健康的貝放于裝有60 L 過濾海水的培養(yǎng)箱（配有溢水 72h、96h、122h、144h 和168h 后，分別從培養(yǎng)箱內(nèi)隨機取出5 只貝，進行毒

25、素分析和酶活性測定。連續(xù)投喂 96h 后停止染毒，繼續(xù)加入過濾海水直至 168h 實驗結(jié)束。開收集。解剖過程在冰上進行，并及時進行毒素的提取，或放在-80100%用組織勻漿器均質(zhì)化并用超聲波細胞破碎儀進行提取，最后用超濾離心膜進行過濾，分析貝的組織 素組成與含量。稱取混合均勻的貝類樣品 0.5 RO-80性測試。1.0g 3mL 甲醇提取 3 次，混合提取溶液后定容至 10mL。將毒素提取溶液過 0.22m 有機系濾膜，Agilent6430串聯(lián)四極桿質(zhì)譜、Agilent1290高效液相色譜USA，a C18（502.1 mm, 3m）色譜的LC-MS/MS系統(tǒng)進行檢測 相B有機系（95%乙腈溶液2mM 有機系（95%乙腈溶液2mM 50mM 甲酸，進行梯度洗脫。電噴霧離子