植物煙草實(shí)驗(yàn)

1、煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)摘 要用不同成分培養(yǎng)基，附加0.8%瓊脂，3%蔗糖，調(diào)pH5.8 6.0,取煙草葉片 作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，計(jì)算污染率、誘導(dǎo)率以及誘導(dǎo)情況，觀察愈傷 組織的發(fā)生情況。實(shí)驗(yàn)表明，養(yǎng)分較高的培養(yǎng)基，外植體生長(zhǎng)情況較好。當(dāng)細(xì)胞分 裂素高于生長(zhǎng)素的濃度時(shí)，有利于分化出芽；細(xì)胞分裂素低于生長(zhǎng)素的濃度時(shí)，有 利于分化出根；當(dāng)細(xì)胞分裂素及生長(zhǎng)素的濃度適合時(shí)，愈傷組織不分化，但是生長(zhǎng) 旺盛。關(guān)鍵詞：煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)刖言煙草（Nicotiana tabaciin又名草煙，屬茄科煙草屬的一年生草本植物，本屬約有60種， 原產(chǎn)于美洲和大洋洲1。煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物和工業(yè)原料作物，其

2、體內(nèi)所含的煙堿等生物 堿是非常寶貴的醫(yī)藥及化工原料。有報(bào)道煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物獲得細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)，因 此很有必要對(duì)煙草的組培快繁進(jìn)行研究，以獲得更有效的方法提高產(chǎn)率和產(chǎn)量?？律茝?qiáng)綜述 植物細(xì)胞的遺傳全能性與組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生控制3，戴冕進(jìn)行了煙草葉肉原生質(zhì)體再生植株 的研究4，徐瑞娟等通過(guò)煙草花序苞葉的離體培養(yǎng)分化出花芽包戰(zhàn)淑敏用煙草葉組織培養(yǎng) 直接獲得再生植株。本實(shí)驗(yàn)以煙草葉片組織為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織，觀察 愈傷組織誘導(dǎo)情況。1.材料與方法1.1配置培養(yǎng)基母液，每2人為一個(gè)小組，配置以下培養(yǎng)基，并分裝，滅菌，然后室溫下 放置一周。第1 4小組MS+2,4-D0.50.8%瓊脂3%

3、蔗糖pH5.86.0MS+6-BA2.0+NAA0.2第5 8小組MS+NAA0.5MS+6-BA1.0+NAA0.5第912組MS+NAA1.0MS+6-BA1.0+2,4- D0.5第13 15組1/2MS+NAA0.5+0.2%ACMS+6-BA2.0+2,4-D0.51.2取煙草葉片取煙草的嫩葉片作外植體。先用自來(lái)水沖洗干凈，再用蒸餾水洗2次后，置 于超凈臺(tái)上，于無(wú)菌條件下先用75%的酒精浸泡30秒，然后置于無(wú)菌瓶中用10%次氯酸鈉溶液浸泡20分鐘至30分鐘，再用無(wú)菌水沖洗4次，最后在無(wú)菌培養(yǎng)皿中將嫩葉片切成1cm見(jiàn)方 小塊，接種在培養(yǎng)基中。1.3.1觀察污染情況：觀察是否有細(xì)菌性污染

4、（菌斑呈粘液狀,接種后1-2天出現(xiàn)）和真菌 性污染（出現(xiàn)不同顏色霉菌，接種后3-10天出現(xiàn)），并計(jì)數(shù)。計(jì)算污染率。污染率（）=污染的材料數(shù)/總接種材料數(shù)X 100%71.3.2觀察各培養(yǎng)基中的外植體產(chǎn)生愈傷組織的情況，愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間和愈傷組織形態(tài)特 征（顏色和質(zhì)地等），計(jì)數(shù)形成愈傷組織的材料數(shù)，并計(jì)算誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率（%）=形成愈傷組織的材料數(shù)/總接種材料數(shù)X100%72.結(jié)果及分析2.1愈傷組織誘導(dǎo)情況三天后發(fā)現(xiàn)部分組有細(xì)菌性污染（如圖1），7天后發(fā)現(xiàn)部分有真菌性污染。計(jì)算出污染率和 如表1所示：表1.愈傷組織誘導(dǎo)的污染情況編號(hào)污染情況污染率12組黃色霉菌污染40.7%34組白色半透明及黃色

5、半透明細(xì)菌污染50.2%56組白色半透明細(xì)菌污染60.5%78組白的霉菌污染，白色細(xì)菌污染56.7910 組有白色放線菌污染30.5%1112 組有灰綠色霉菌污染和白色細(xì)菌污染46.5%1315 組有一瓶被灰色霉菌污染11%造成污染的可能原因有：葉片消毒滅菌不徹底，接種室超凈工作臺(tái)消毒不徹底，接種操 作時(shí)操作不規(guī)范等等。葉片在第4天后邊緣慢慢上卷，外植體開(kāi)始膨脹，于接種后第7天膨大成圓拱型，愈 傷首先發(fā)生在葉片邊緣，為黃綠色顆粒狀，有些呈現(xiàn)半透明。隨著進(jìn)一步培養(yǎng),10天愈傷組 織不斷加大。排除褐變及感染的外植體后，誘導(dǎo)情況如表2所示：表2,愈傷組織誘導(dǎo)情況培養(yǎng)基成分誘導(dǎo)情況誘導(dǎo)率MS+2,4-

6、D0.5愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，未見(jiàn)分化100%MS+6-BA2.0+NAA0.2愈傷組織生長(zhǎng)正常，后期分化出芽100%MS+NAA0.5愈傷組織生長(zhǎng)正常，未見(jiàn)分化100%MS+6-BA1.0+NAA0.5愈傷組織生長(zhǎng)正常，未見(jiàn)分化100%MS+NAA1.0愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，后期分化出根100%MS+6-BA1.0+2,4- D0.5愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，未見(jiàn)分化100%1/2MS+NAA0.5+0.2%AC愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，可見(jiàn)根的分化33.3%MS+6-BA2.0+2,4-D0.5愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，未見(jiàn)分化100%MS+NAA0.5 培養(yǎng)基MS+6-BA2.0+2,4-D0.5 培養(yǎng)基1/2MS+N

7、AA0.5+0.2%AC 培養(yǎng)基MS+6-BA2.0+NAA0.2 培養(yǎng)基MS+6-BA1.0+2,4- D0.5 培養(yǎng)基MS+6-BA1.0+NAA0.5 培養(yǎng)基外植體從切口邊緣開(kāi)始膨脹。有研究表明，外植體邊緣開(kāi)始膨脹時(shí)，葉肉細(xì)胞已經(jīng)明顯 增大，在切口附近的葉肉細(xì)胞，一些靠近小的維管束的柵欄組織細(xì)胞以及這些維管組織的薄 壁細(xì)胞開(kāi)始細(xì)胞分裂；當(dāng)形成少量的愈傷組織時(shí)，由于激素的誘導(dǎo)作用，在切口處已形成一 團(tuán)活躍分裂的細(xì)胞，細(xì)胞體積明顯減小，這種細(xì)胞分裂活動(dòng)這時(shí)已擴(kuò)展到其它部分的葉肉組 織；在葉組織中形成了大量的分散的分生細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞體積進(jìn)一步減小，在這些活躍分裂的 部位通常已無(wú)法辨認(rèn)原來(lái)的葉肉細(xì)

8、胞圓。在本組的培養(yǎng)基中愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，未見(jiàn)分化，原因是本組的培養(yǎng)基中，細(xì)胞分裂素 6-BA及生長(zhǎng)素NAA的濃度合適，比較有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，而不太利于根和芽的分化。 而在他組的高細(xì)胞分裂素，低生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中，添加了活性炭，有根的分化。原因可能是 活性炭能吸附有害物質(zhì)，減少負(fù)面影響，而且會(huì)使培養(yǎng)基變黑，創(chuàng)造暗環(huán)境，故相比其它培 養(yǎng)基更有利于植物生根9。3.討論不同的培養(yǎng)基會(huì)造成外植體不同的生長(zhǎng)情況，其中，養(yǎng)分較高的培養(yǎng)基，外植體生長(zhǎng)情 況較好。而不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)于外植體的愈傷組織誘導(dǎo)及分化有著重要的影響，當(dāng)細(xì)胞分 裂素6-BA高于生長(zhǎng)素NAA的濃度時(shí)，有利于分化出芽；細(xì)胞分裂素6-BA低

9、于生長(zhǎng)素NAA的 濃度時(shí)，有利于分化出根；當(dāng)細(xì)胞分裂素6-BA及生長(zhǎng)素NAA的濃度適合時(shí)，愈傷組織不分 化，但是生長(zhǎng)旺盛。在組織培養(yǎng)中，形成的愈傷組織有疏松型和致密型兩種，疏松型的愈傷組織易于分化， 將其進(jìn)行繼代培養(yǎng)效果更好。在李大衛(wèi)等對(duì)大麗花的研究中us也說(shuō)明了這個(gè)問(wèn)題。再分化 培養(yǎng)時(shí)，愈傷組織的初始狀態(tài)不同，再分化的能力相差很大，疏松型愈傷組織是外植體在脫 分化過(guò)程中，最早、最快分化出來(lái)的愈傷組織塊;而致密型愈傷組織，則是在脫分化過(guò)程中， 生長(zhǎng)較慢的組織塊，以后又繼續(xù)用脫分化培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)出來(lái)的。所以，再分化培養(yǎng)時(shí)， 應(yīng)選取疏松型愈傷組織，以利于大量出苗。而繼代培養(yǎng)在初轉(zhuǎn)接時(shí)，繼代增殖倍

10、數(shù)較低，增殖率也較低；隨著繼代次數(shù)的增加，其增 殖倍數(shù)逐漸提高。原因是在嫩芽中逐步積累了較多的細(xì)胞分裂素，并逐漸適應(yīng)了培養(yǎng)條件， 通常將這一過(guò)程叫做馴化階段；植物組織對(duì)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的要求也會(huì)有所降低；當(dāng)繼 代增殖培養(yǎng)到達(dá)一定代數(shù)后，增殖倍數(shù)到達(dá)最高點(diǎn)，隨后慢慢下降，同時(shí)，芽苗逐漸變得肥大、 結(jié)構(gòu)疏松、顏色變白或逐漸變得圓短u。因此用誘導(dǎo)出的大塊愈傷組織雖然可以獲得大量的 小植株，但是繼代培養(yǎng)多代后，效率就會(huì)明顯降低。參考文獻(xiàn)1周仕順，掏志章.煙草的組織培養(yǎng)J.云南農(nóng)業(yè)科技，2005,(01)： 22施和平，黃群聲.煙草葉片組織培養(yǎng)及植株再生(簡(jiǎn)報(bào))J.亞熱帶植物科學(xué)，2003,(04)

11、:63柯善強(qiáng).植物細(xì)胞的遺傳全能性與組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生控制J.武漢植物學(xué)研究，1987,(03):303 312戴冕，崔植琳.煙草葉肉原生質(zhì)體再生植株的研究.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),1992,(3):2122徐瑞娟，李文安.煙草花序苞葉的離體花芽分化J.云南植物研究，1992,(01):6772戰(zhàn)淑敏.煙草葉組織培養(yǎng)直接獲得再生植株.萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1993,(2):131132潘瑞熾，施和平，王小菁，李玲.植物細(xì)胞工程.廣州：廣東高等教育出版社：159許智宏,劉桂云.煙草葉組織培養(yǎng)中愈傷組織和芽形成的細(xì)胞學(xué)觀察J.Journal ofIntegrative Plant Biology,1980,(01): 1 5潘瑞熾，施和平，王小菁，李玲.植物細(xì)胞工程.廣州：廣東高等教育出版社：21李大衛(wèi)，劉志強(qiáng)，刁曉歌大麗花(Dahlia