酶免基礎知識和血篩產(chǎn)品介紹課件

1、酶聯(lián)免疫檢測技術簡介血液篩查試劑特點及發(fā)展歷程北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司汪 月 才 2012年3月一、酶聯(lián)免疫檢測技術簡介什么是ELISA?免疫測定（immunoassay，IA）是應用免疫學技術測定標本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質(zhì) 。 ELISA是一種免疫測定?；A定義抗原（Antigen）：能在機體中引起特異性免疫應答的物質(zhì)?？贵w（Antibody）：能與抗原特異性結合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關的Ig主要為IgG和IgM。機體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗

2、體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。重要指標靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。特異性：鑒別陰性標本的能力。精密度：指對同一個標本進行重復分析，其結果間的符合率。ELISA檢測方法 1.夾心法. 2.間接法. 3.競爭法. 4.捕獲法.夾心法雙抗原夾心：固相(包被)抗原Ag + 樣品(抗體Ab) + 酶標抗原Ag* Ag-Ab-Ag* + 底物(TMB)顯色雙抗體夾心：固相(包被)抗體Ab + 樣品(抗原Ag) + 酶標抗體Ab * Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)顯色間接法固相(包被)抗

3、原Ag + 樣品(抗體Ab) + 酶標二抗Ab* Ag-Ab-抗Ab* + 底物(TMB)顯色TMB+H2O2樣品酶標二抗底物包被抗原競爭法固相(包被)抗原Ag + 樣品(無抗體Ab) + 酶標抗體Ab* Ag-Ab* + 底物(TMB)顯色 捕獲法固相-抗IgM抗體(抗) + 樣品(IgM) 抗-IgM + 酶標抗原Ag* 抗-IgM-Ag* + 底物(TMB)顯色 TMB+H2O2樣品酶標抗原包被抗IgM底物二、血液篩查試劑特點及發(fā)展歷程1、人類免疫缺陷病毒診斷試劑第三代檢測試劑簡介全稱：人類免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗體診斷試劑盒方法：雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法（第三代）檢測對象：血液標本

4、中的HIV總抗體原料：基因重組（萬泰和廈大合作研制），包被GP41、GP120、GP36，片段齊全。檢測窗口期：20天左右基 因 重 組 多 表 位 嵌 合 抗 原對HIV-2型陽性出色的檢測能力試劑盒內(nèi)設置有HIV 型和型陽性對 照，為國產(chǎn)試劑首創(chuàng)，我們使用美國BBI 血清盤Panel202對萬泰試劑進行考核。 對HIV O亞型的檢測O亞型血來源于美國BBI超強的抗干擾能力臨床研究顯示，多種其他疾病潛在干擾因素血清標本均不會影響萬泰兩步法HIV診斷試劑盒的靈敏度和特異性，適合臨床使用國產(chǎn)第四代HIV診斷產(chǎn)品明顯縮短窗口期25結 論 HIV Ag/Ab診斷試劑全新第四代 HIV 篩查試劑為使用

5、者提供 :增強檢驗安全性更可信賴的實驗結果簡 介1、乙型肝炎HBsAg及HBsAb檢測2、乙型肝炎HBeAg及HBeAb檢測3、乙型肝炎HBcAb及HBcAb-IgM檢測4、乙型肝炎前-S1及前-S2檢測（大蛋白）5、乙型肝炎HBcAg及前-S1檢測（ Dane顆粒）6、乙型肝炎核酸檢測乙肝標志物及臨床意義1乙型肝炎病毒（HBV）具有明顯的種屬及嗜肝特性，可致持續(xù)性病毒感染。我國屬乙肝感染的高發(fā)區(qū)，乙肝表面抗原（HBsAg）的攜帶者超過10%。通常判斷HBV感染及其狀況的指標為HBV血清血標志物乙肝兩對半、HBc-IgM、HBV DNA等。乙肝病毒（HBV）又稱Dane顆粒（丹顆粒），由外至內(nèi)

6、可分為包膜蛋白、核殼蛋白、HBV DNA等主要組成。包膜蛋白構成乙肝病毒表面抗原（HBsAg）核殼蛋白構成乙肝病毒核心抗原（HBcAg）和乙肝病毒e抗原（HBeAg）乙肝標志物及臨床意義2乙肝表面抗原（HBsAg） HBsAg于1963年在澳大利亞土著人血中發(fā)現(xiàn)，故也稱為澳大利亞抗原（簡稱“澳抗”），具有免疫原性，可刺激機體產(chǎn)生相應的抗體，是機體感染HBV后最早出現(xiàn)的血清血指標。 HBsAg分為4個亞型：adr、adw、ayw和ayr。不同亞型的HBsAg刺激機體產(chǎn)生的HBsAb不同。乙肝標志物及臨床意義3乙肝表面抗體（HBsAb） HBsAg刺激機體產(chǎn)生的特異性抗體，能中和體液中的HBV，感

7、染乙肝病毒后6-23周出現(xiàn)。見于乙肝恢復期、HBV既往感染和乙肝疫苗免疫后。HBsAb滴度10mIU表示具有保護性，可抵御同一亞型的再感染。乙肝標志物及臨床意義4乙肝病毒核心抗原（HBcAg） HBV核心顆粒外表面具有HBcAg活性，但外周血中沒有游離的HBcAg。HBcAg陽性表示有Dane顆粒存在，有傳染性。乙肝標志物及臨床意義5乙肝核心抗體（HBcAb） HBcAb是乙肝核心抗原的總抗體。感染HBV后最早出現(xiàn)的抗體是HBc-IgM抗體，它是乙肝病毒急性感染的重要指標，慢性肝炎的炎癥活動期也呈陽性。核心抗體不是中和抗體，HBc-IgG抗體可持續(xù)多年不消退，是既往感染的指標。乙肝標志物及臨床

8、意義6乙肝e抗原（HBeAg） HBV核心顆粒內(nèi)表面具有HBeAg活性，也可以由HBcAg經(jīng)蛋白酶降解后產(chǎn)生，在乙肝潛伏期后期出現(xiàn)，略晚于HBsAg。HBeAg陽性表示HBV在體內(nèi)復制，有很強的傳染性。 進入恢復期后，HBeAg隨著HBsAg的消失而消失，其消失前后出現(xiàn)HBeAb。乙肝標志物及臨床意義7乙肝e抗體（HBeAb） HBeAb的出現(xiàn)預示HBV復制減弱或中止，疾病可能向好的方向轉化。HBeAg逐漸消失HBeAb逐漸產(chǎn)生的時期稱為血清轉換期，即由復制期轉為非復制期。在這一時期可能出現(xiàn)eAg、eAb同陽的現(xiàn)象。HBeAb也不是保護性抗體。乙肝標志物產(chǎn)生的先后順序HBsAg(HBcAg)H

9、BcAbHBeAgHBeAb 乙肝兩對半模式常見模式（出現(xiàn)率140%） 模式sAgsAbeAgeAbcAb出現(xiàn)率臨床意義13040%a、急、慢性肝炎b、提示HBV復制21015%a、急性HBV復制b、慢性HBsAg攜帶者c、傳染性弱 3510%a、急性HBV趨向恢復b、慢性HBsAg攜帶者c、長期持續(xù)容易癌變4130%未感染過HBV5515%a、既往感染，仍有免疫力b、非典型恢復型，急性HBV感染模式sAgsAbeAgeAbcAb出現(xiàn)率臨床意義6210%a、既往感染過HBVb、急性HBV感染恢復c、少數(shù)標本仍有傳染性7510%a、既往感染過HBVb、急性HBV感染窗口期816%a、被動或主動免

10、疫后b、HBV感染后已經(jīng)康復9 -0.55%a、既往感染過HBVb、急性HBV感染后已經(jīng)康復常見模式（出現(xiàn)率140%） 少見模式（出現(xiàn)率14%）模式sAgsAbeAgeAbcAb臨床意義10a、慢性HBsAg攜帶者，傳染性弱b、急性HBV感染11a、慢性HBsAg攜帶者易轉陽易發(fā)生基因整合b、急性HBV感染趨向恢復12早期HBV感染或慢性攜帶者，傳染力強13a、急性HBV感染，趨向恢復b、慢性HBsAg攜帶者14a、亞臨床型HBV感染早期b、不同亞型HBV二次感染15模式sAgsAbeAgeAbcAb臨床意義16亞臨床型或非典型感染1718亞臨床型或非典型感染早期19a、非典型性急性感染b、提

11、示NANBH20非典型性急性感染少見模式（出現(xiàn)率14%）少見模式（出現(xiàn)率14%）模式sAgsAbeAgeAbcAb臨床意義 21急性HBV感染中期22HBV感染后已經(jīng)康復23亞臨床型或非典型感染2425HBV感染后趨向康復3、丙型肝炎診斷試劑抗-HCV檢測中HCV的抗原5UTR C E1 E2 NS2 NS3 NS4 NS5 3UTR 結構區(qū) 非結構區(qū)第一代 c100 第二代 C22 C33c c100第三代 C22 C33c c100 NS5簡介全稱：丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒方法：間接酶聯(lián)免疫法（第三代）檢測對象：血液標本中的HCV IgG 抗體原料：基因重組，包被NS3、NS4、NS5、

12、CORE，片段齊全。窗口期檢測針對HCV四種抗原的抗體第二代試劑在感染后平均10周左右可以檢出第三代試劑感染后平均7-8周為陽性在極少數(shù)病例中，如免疫抑制、腎功能衰竭等，抗-HCV可以保持陰性檢定所考評市場流通的HCV抗體檢測試劑發(fā)展方向1、雙抗原夾心法代表生產(chǎn)企業(yè)：北京萬泰目前進度：完成臨床考核，等待批準文號2、抗原抗體聯(lián)合檢測方法代表生產(chǎn)企業(yè)：美國伯樂目前進度：2009年在歐洲上市，2012年下半年引入中國4、TP簡 介全稱：梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒方法：雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法檢測對象：血液標本中的梅毒總抗體原料：基因重組原料包被P15、P17、P47。常用梅毒檢測方法的比較TP EIA 與

13、TPPA的比較病人血清數(shù)量梅毒檢測陽性梅毒檢測陰性類風濕10010乙肝20020紅斑狼瘡606 標本：類風濕病人血清10份，乙肝病人血清20份，紅斑狼瘡病人血清6份。來源于解放軍301醫(yī)院。 結論：在被檢測的36份血清中，未發(fā)現(xiàn)假陽性反應。萬泰TP試劑對特殊標本的檢測 檢測單位：北醫(yī)第一醫(yī)院皮膚科、新疆HIV檢測中心結論：萬泰梅毒EIA靈敏度較TPPA好部分臨床考核數(shù)據(jù)6、膠體金系列試紙條的結構及制造工藝WT1234567881. 塑料底襯2. 黏合劑3. 硝酸纖維素膜4. 對照線5. 檢測線6. 交聯(lián)墊（樣品墊）7. 吸水紙8. 保護膜試紙條圖解試紙條工作原理 在硝酸纖維素膜的檢測線上包被有

14、特異性抗體，對照線上包被有兔抗抗體，另一個特異性抗體在標記膠體金后干燥于硝酸纖維素膜下端的玻璃纖維上。 當樣品由于層析原理流動時，首先溶解干燥的金標sAb單抗，特異性HBsAg抗原與其反應，在流過檢測線時再和另一個單抗結合形成免疫復合物。由于包被單抗被固定在硝酸纖維素膜上，免疫復合物就被留下，逐漸形成肉眼可見的紅紫色條帶，此時該樣品為陽性。繼續(xù)流動到對照線時，金標sAb單抗和羊抗兔IgG結合顯色，出現(xiàn)對照帶。 當樣品中不含HBsAg特異性抗原時，標記膠體金的單抗流過對照線時也可和該處的羊抗兔抗體結合也可形成紅紫色條帶，導致對照線顯色。WT膠體金試紙條的優(yōu)缺點： （1）優(yōu)點:(a)靈敏度適中； (b)使用方便，適于快速診斷； (c)易于存放，效期長。 （2）缺點:(a) 應用時間短，范圍?。?(b)部分項目靈敏度較低； (c) 價格較貴。三、新版藥典對血篩試劑改進及意義2010版中國藥典新要求2010版中國藥