凱氏定氮法精品課件

1、凱氏定氮法第1頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一測(cè)定總氮量 N%F =粗蛋白質(zhì)含量%因?yàn)椋簶悠分谐鞍椎?，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物堿、含氮類脂、卟啉和含氮色素等。第三節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定！第2頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一一、凱氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。改良：氮的完全氨化，縮短時(shí)間，簡(jiǎn)化操作。 主要改良催化劑及消化蒸餾裝置。第3頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一（一）常量凱氏定氮法原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱

2、消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl滴定或H2SO4溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過量的酸。第4頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一催化劑煮沸1、消化：NCOC + 濃H2SO4 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O 2、蒸餾與吸收： 2NaOH +（NH4）2SO4 2NH3+Na2SO4 + 2H2O 2NH3 + 4H3BO3 （NH4）2B4

3、O7 + 5H2O 3、滴定：（NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl 2NH4Cl + 4H3BO3 (注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds )凱氏定氮法原理（方程式）整個(gè)過程分三步：消化、蒸餾與吸收、滴定第5頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一1. 消化加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)，純硫酸沸點(diǎn) 340，加入硫酸鉀之后可以提高至400以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。要防止暴沸第6頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一 加硫酸銅 作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示

4、劑、蒸餾時(shí)堿性指示劑。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦。 加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī) 物氧化速度。第7頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一凱氏定氮法注意事項(xiàng)圖：常量凱氏定氮消化及蒸餾裝置 a消化裝置 b蒸餾吸收裝置1、裝置的氣密性2、何時(shí)加堿3、火候控制4、難消化的 對(duì)策5、停止蒸餾第8頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一自動(dòng)回流消化蒸餾儀第9頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一2. 蒸餾與吸收消化液 + 40%氫氧化鈉，加熱蒸餾，放出氨氣。 “以奈氏試劑”檢查。同時(shí)用4%硼酸吸收Nessler試劑，K

5、2（HgI4）檢驗(yàn)NH4+離子，析出黃色或紅棕色沉淀。第10頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一3. 滴定用HCl滴定用混合指示劑（甲基紅+溴甲酚綠或亞甲基蘭+甲基紅） 終點(diǎn)：藍(lán)色微紅色計(jì)算：F要根據(jù)樣品來源定 第11頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一說明及注意：本法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定（粗蛋白質(zhì)）。結(jié)果準(zhǔn)確，但費(fèi)時(shí)。所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。同時(shí)作一空白試驗(yàn)，從消化開始到滴定。消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。第12頁，共21頁，2022年，5月20日，9

6、點(diǎn)19分，星期一 消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪?，并促進(jìn)其消化完全。 樣品中若含脂肪或糖較多時(shí)，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30過氧化氫 23 m1 后再繼續(xù)加熱消化。第13頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一 般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間（如大豆粉）。有

7、機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。蒸餾裝置不能漏氣。蒸餾時(shí)，加熱火力要穩(wěn)定，否則將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。(NH4)2SO4 檢驗(yàn)第14頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一蒸餾前加NaOH要足量，溶液應(yīng)變?yōu)樯钏{(lán)色或黑褐色（Cu（OH）2、CuO、銅氨離子），如顏色不變可能堿不夠 。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源否則可能造成吸收液倒吸。H3BO3吸收液的溫度不應(yīng)超過40，否則對(duì)NH3的吸收作用減弱而造成損失。 第15頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一（二）微量凱氏定氮法1、原理、步驟及適用范圍同前2

8、、與常量法不同點(diǎn)：樣品量、試劑用量 減少加入硼酸量由50 ml 10 ml,滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。3、蒸餾裝置見下圖 。第16頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一保持酸性第17頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一第18頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一改良式微量凱氏定氮裝置 第19頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一（三）自動(dòng)凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前 2、特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。第20頁，共21頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)19分，星期一如何測(cè)定蛋白氮？ 先把非蛋