蒙藥三子散醇提物化學(xué)成分的HPLC-Q-Exactive-MS快速分析與鑒定

1、PAGE 8 -蒙藥三子散醇提物化學(xué)成分的HPLC-Q-Exactive-MS快速分析與鑒定李君胡玉霞張夢迪王躍武張謙胡格吉胡高峰常福厚關(guān)鍵詞蒙藥;三子散;高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜;成分組成;結(jié)構(gòu)鑒定三子散系蒙古族經(jīng)典名方，收載于2022年版中國藥典（一部），由訶子、川楝子、梔子3味藥材按111配比組成1。該方具有清血熱、解毒等功效，將其制成糊狀外用還具有收斂、止痛、消炎的作用，蒙醫(yī)臨床用于溫?zé)?、血熱、眩暈、新久熱等疾病的治??，F(xiàn)有研究表明，三子散所含化學(xué)成分主要包括環(huán)烯醚萜苷類、鞣質(zhì)類、黃酮類、有機(jī)酸類等3，但其在疾病治療過程中發(fā)揮藥效的活性成分尚不清楚。而明確該方的化

2、學(xué)物質(zhì)組成是闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要前提。本課題組前期采用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)，以方中沒食子酸、阿魏酸、梔子苷、槲皮素、川楝素等10種成分含量為指標(biāo)，通過正交實驗對三子散的醇提工藝進(jìn)行了優(yōu)化4，并在最優(yōu)提取工藝的支撐下，通過冷凍干燥技術(shù)獲得了三子散醇提物。在此基礎(chǔ)上，本研究采用具有分析周期短、檢測靈敏度高等特點的高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC-Q-Exactive-MS）技術(shù)對三子散醇提物中的復(fù)雜化學(xué)成分進(jìn)行快速在線分離與鑒定，從而為后續(xù)該方移行入血成分分析、藥動學(xué)-藥效學(xué)相關(guān)性研究等提供基礎(chǔ)，進(jìn)而闡明該方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。1材料1.1主要儀器HPLC-Q-

3、Exactive型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（含Ultimate3000型色譜儀、Q-Exactive型高分辨質(zhì)譜儀）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;AP135W型十萬分之一電子天平購自日本Shimadzu公司;KH-500DV型數(shù)控超聲波清洗器購自昆山禾創(chuàng)超聲有限公司;2TB-A型磁力加熱攪拌電熱套購自山東鄄城華魯電熱儀器有限公司;RE3000A型全自動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自鄭州科達(dá)機(jī)械儀器設(shè)備有限公司;FDU2110型冷凍干燥機(jī)購自東京理化器械株式會社。1.2主要藥品與試劑梔子（批號19072703，產(chǎn)地為江西）、川楝子（批號202202231，產(chǎn)地為四川）、訶子（批號20222403，產(chǎn)地為

4、云南）飲片均購自內(nèi)蒙古北域藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥資源教研室渠弼教授鑒定分別為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis、楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.etZucc.和絨毛訶子TerminaliachebulaRetz.vartomentellaKurt.的干燥成熟果實。川楝素（批號111824-202204，純度96.9%）、梔子苷（批號110749-202218，純度97.6%）、山柰酚（批號110861-202213，純度98.0%）、沒食子酸（批號110831-202205，純度98.8%）、鞣花酸（批號111959-2022

5、03，純度88.8%）、槲皮素（批號100081-202210，純度99.1%）、阿魏酸（批號110773-202214，純度99.0%）、蘆?。ㄅ?1020402，純度98.0%）、綠原酸（批號110753-202218，純度96.1%）9種對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;柯里拉京（批號DST190113-012，純度98.2%）、木犀草素（批號DSTDM003201，純度98.0%）、齊墩果酸（批號DSTDQ005101，純度98.0%）3種對照品均購自成都德思特生物科技有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸、乙酸銨均為分析純，水為超純水。2方法2.1色譜-質(zhì)譜條件采用Shim-pac

6、kGIST-HPC18色譜柱（150mm4.6mm，3m），以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（010min，10%A;1015min，10%A30%A;1525min，30%A70%A;2530min，70%A90%A;3035min，90%A;3540min，10%A）;流速為1mL/min;柱溫為40;進(jìn)樣量為10L。采用電噴霧離子源（ESI），在正、負(fù)離子檢測模式下檢測。正離子檢測模式下的檢測條件為：輔助氣體積流量30L/min，噴霧電壓3.50kV，離子傳輸管溫度300，輔助氣溫度200，碰撞能量45eV;負(fù)離子檢測模式下的檢測條件為：輔助氣體積流量30L/mi

7、n，噴霧電壓2.80kV，離子傳輸管溫度400，輔助氣溫度100，碰撞能量30eV。檢測方式為FullMS/dd-MS2，F(xiàn)ullMS分辨率為70000，dd-MS2分辨率為17500，掃描范圍為m/z1101200。2.2溶液的制備2.2.1供試品溶液的制備根據(jù)前期實驗基礎(chǔ)4，按處方比例稱取川楝子、梔子、訶子飲片，粉碎，混勻，過60目篩。稱取混合粉末共約180.00g，置于圓底燒瓶中，加50%乙醇1800mL，用電熱套加熱回流提取3次、每次1.5h，分別過濾并收集濾液。合并3次濾液，旋蒸濃縮，回收乙醇，濃縮液冷凍干燥，得到三子散醇提物凍干粉。稱取上述凍干粉1.0g于10mL量瓶中，加甲醇至刻

8、度后稱質(zhì)量，超聲（功率200W，頻率50kHz）20min，冷卻至室溫，再次稱定其質(zhì)量，以甲醇補足減少的質(zhì)量，經(jīng)0.22m微孔濾膜濾過，即得。2.2.2對照品溶液的制備精密稱取川楝素、梔子苷、齊墩果酸、山柰酚、沒食子酸、鞣花酸、柯里拉京、槲皮素、阿魏酸、蘆丁、木犀草素、綠原酸12種對照品各適量，分別置于不同10mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成上述12種成分質(zhì)量濃度分別為475、201、258、285、206、200、239、237、255、228、292、344g/mL的單一對照品貯備液。分別精密量取上述各單一對照品貯備液適量，置于同一10mL量瓶中，加甲醇定容，制成上述12種成分質(zhì)量濃度分別

9、為950、402、516、570、412、400、478、474、510、456、584、688ng/mL的混合對照品溶液，將其置于4保存，備用。2.3數(shù)據(jù)庫的建立及分析利用中國知網(wǎng)、萬方等數(shù)據(jù)庫檢索有關(guān)三子散全方及各單味藥材化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)，將收集的化學(xué)成分信息進(jìn)行匯總，建立一個包括化合物名稱、分子式、精確分子量、一級和多級質(zhì)譜碎片等信息的本地數(shù)據(jù)庫，從而為化合物的鑒定提供參考。將供試品溶液和對照品溶液在正、負(fù)離子模式下檢測到的質(zhì)譜信息導(dǎo)入Xcalibur3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用HPLC-Q-Exactive-MS高分辨質(zhì)譜計算化合物的精確分子量，再結(jié)合保留時間、質(zhì)譜信息及Xcalib

10、ur3.0軟件擬合的分子式，通過與已建立數(shù)據(jù)庫中化合物信息和部分對照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，以實際測得與理論的偏差小于10ppm為原則5，快速鑒別出三子散醇提物中所含有的固有化學(xué)成分。3結(jié)果3.1三子散醇提物的總離子流圖及成分分析按“2.1”項下色譜-質(zhì)譜條件，對三子散醇提物進(jìn)行HPLC-Q-Exactive-MS檢測分析，獲得了三子散醇提物在正、負(fù)離子檢測模式下的總離子流圖（見圖1）。根據(jù)“2.3”項下分析方法，最終鑒定出化合物64個，包括9個黃酮類成分、13個環(huán)烯醚萜類成分、14個有機(jī)酸類成分、18個鞣質(zhì)類成分、3個三萜類成分、3個氨基酸類成分和4個脂肪酸類成分。其中，有11個成分的結(jié)構(gòu)通過與

11、對照品比對得到了確證。三子散醇提物化學(xué)成分的HPLC-Q-Exactive-MS鑒定結(jié)果見表1。3.2成分鑒定過程分析鑒于同類成分具有相似的裂解規(guī)律，本文選取組方中主要含有的環(huán)烯醚萜類成分、黃酮類成分、有機(jī)酸類成分和鞣質(zhì)類成分為例進(jìn)行成分鑒定過程分析。3.2.1環(huán)烯醚萜類成分在組方中共鑒定出環(huán)烯醚萜類化合物13個。本研究以梔子苷（化合物33）為例來說明環(huán)烯醚萜類成分的結(jié)構(gòu)鑒定過程：在負(fù)離子檢測模式下可見m/z433.13382M+COOH-的準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子峰相繼脫去1分子甲酸和1分子中性碎片葡萄糖殘基后產(chǎn)生碎片離子峰m/z225.07703M-HGlu-，然后進(jìn)一步丟失1分子H2O得

12、到碎片離子峰m/z207.06587M-H-Glu-H2O-，隨后苷元進(jìn)一步發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)產(chǎn)生碎片離子峰m/z123.04395。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片離子峰信息及與對照品比對結(jié)果5，7，確認(rèn)化合物33為梔子苷。梔子苷對照品和化合物33的二級質(zhì)譜（MS2）圖分別見圖2、圖3，梔子苷可能的裂解途徑見圖4。3.2.2黃酮類成分在組方中共鑒定出黃酮類化合物9個。本研究以蘆丁（化合物39）為例來說明黃酮類成分的結(jié)構(gòu)鑒定過程：在負(fù)離子檢測模式下可見m/z609.14722M-H-的準(zhǔn)分子離子峰，并發(fā)現(xiàn)其主要二級碎片離子峰為m/z301.03476、m/z300.02780、m/z2

13、71.02527、m/z151.00262，即準(zhǔn)分子離子峰通過碰撞解離丟失蕓香糖產(chǎn)生碎片離子峰m/z301.03476M-HC12H20O9-，并進(jìn)一步脫去1個氫產(chǎn)生碎片離子峰m/z300.02780M-H-C12H20O9-H-，或脫去1個中性碎片H2CO產(chǎn)生碎片離子峰m/z271.02527M-H-C12H20O9-H2CO-，或發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)產(chǎn)生碎片離子峰m/z151.00262。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片離子峰信息及與對照品比對結(jié)果，確認(rèn)化合物39為蘆丁11。蘆丁對照品和化合物39的MS2圖分別見圖5、圖6，蘆丁可能的裂解途徑見圖7。3.2.3有機(jī)酸類成分在組方中共鑒

14、定出有機(jī)酸類化合物14個。本研究以綠原酸（化合物28）為例來說明有機(jī)酸類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定過程：在負(fù)離子檢測模式下可見m/z353.08774M-H-的準(zhǔn)分子離子峰，其特征裂解途徑為結(jié)構(gòu)中酯鍵斷裂產(chǎn)生奎寧酸（quinicacid，QA）及咖啡酸（caffeicacid，CA），主要二級碎片離子峰為m/z191.05554QA-H-、m/z179.03423CA-H-、m/z173.04475QA-H-H2O-、m/z135.04410CA-HCO2-，即準(zhǔn)分子離子峰脫去咖啡酰氧基或奎尼酸基團(tuán)產(chǎn)生m/z191.05554QA-H-或m/z179.03423CAH-的特征碎片離子峰，然后進(jìn)一步丟失1

15、分子CO2或1分子H2O產(chǎn)生m/z173.04475QA-H-H2O-、m/z135.04410CA-H-CO2-的碎片離子峰。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與對照品的比對結(jié)果，確認(rèn)化合物28為綠原酸9-10。綠原酸對照品和化合物28的MS2圖分別見圖8、圖9，綠原酸可能的裂解途徑見圖10。3.2.4鞣質(zhì)類成分在組方中共鑒別出鞣質(zhì)類化合物18個。本研究以柯里拉京（化合物30）為例來說明鞣質(zhì)類成分的結(jié)構(gòu)鑒定過程：在負(fù)離子檢測模式下可見m/z633.07440M-H-的準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子峰失去1分子沒食子酰葡萄糖單元形成特征碎片離子峰m/z300.99939M-H-galloyl-

16、glu-，或失去1分子葡萄糖單元和1分子六羥基二苯甲酰基（HHDP）產(chǎn)生碎片離子峰m/z169.01334M-H-glu-HHDP-。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與對照品比對的結(jié)果，確認(rèn)化合物30為柯里拉京11?？吕锢φ掌泛突衔?0的MS2圖分別見圖11、圖12，柯里拉京可能的裂解途徑見圖13。4討論在前期預(yù)實驗中，本課題組對不同流動相體系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸溶液）進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在流動相中加入適量甲酸能夠明顯改變組方中成分的質(zhì)譜響應(yīng)值;而與甲醇比較，采用乙腈為流動相組成部分能夠顯著提高組方中各成分的分離度。因此，本研究采用乙

17、腈-0.1%甲酸溶液作為流動相體系。由于傳統(tǒng)復(fù)方制劑中成分較多且響應(yīng)模式不盡相同，為獲得全面的質(zhì)譜信息，本研究采用正、負(fù)離子全掃描模式對三子散醇提物中的化學(xué)成分進(jìn)行了辨識分析。結(jié)果，在三子散醇提物中共鑒定出64個化學(xué)成分，以環(huán)烯醚萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類、有機(jī)酸類為主。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，環(huán)烯醚萜類成分梔子苷在抗炎、抗氧化、降壓、調(diào)脂等方面作用顯著，并具有保肝利膽的作用17-18。黃酮類化合物存在于多種藥用植物中，具有多重生物活性：槲皮素可通過縮小心肌梗死面積、降低心肌髓過氧化物酶活力而發(fā)揮心肌保護(hù)作用19;蘆丁具有顯著的抗炎活性，且該作用可能與其減少促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)20。鞣質(zhì)類成分大多具有抗真菌及抗腫瘤活性，同時對結(jié)腸癌、肝癌和宮頸癌細(xì)胞均表現(xiàn)出了一定的抑制作用11。此外，本研究還鑒定出了多種有機(jī)酸類成分，其在心血管相關(guān)疾病方面作用廣泛：蘋果酸可提高琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶