高效液的相色譜法

1、高效液相色譜法2011年7月14日1主要內(nèi)容基本原理儀器日常維護與簡單故障排除液相色譜法是指流動相為液體的色譜技術(shù)。采用顆粒十分細的高效固定相，并采用高壓泵輸送流動相，全部工作通過儀器來完成，這種新的色譜法稱為高效液相色譜法。它可用來做液固吸附、液液分配、離子交換、空間排阻色譜分析。高效液相色譜法高壓：液體作為流動相流經(jīng)色譜柱時，受到 的阻力較大，施加高壓能使液體迅速通過，一般高達150-350 105Pa。高速：載液在色譜柱內(nèi)的流速較之經(jīng)典液相色譜法高得多，一般可達1-10mL/min。高效：高效液相色譜法的柱效能可達3萬塔板/米，而氣相色譜法的柱效能僅為2000塔板/米。高靈敏度：采用高靈

2、敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度，熒光檢測器可達10-11 g 。高效液相色譜法特點高效液相色譜與氣相色譜的比較樣品的熱不穩(wěn)定性樣品分子量HPLC室溫或低于室溫均可作分析測試氣相色譜樣品必須在高溫進樣口及色譜柱均不會受到任何破壞HPLC氣相色譜理論上講，沒有上限實際上有溶解性的限制通常情況下 小于 500 amu高效液相色譜與氣相色譜的比較樣品制備進樣量HPLC固定相和流動相均參與氣相色譜溶劑必須具有揮發(fā)性，且其通常比被分析物沸點低HPLC氣相色譜進樣量取決于色譜柱內(nèi)徑通常情況下為1-5 L高效液相色譜與氣相色譜的比較分離機理檢測器HPLC固定相和流動相均參與氣相色譜流動相僅作為樣品載體

3、HPLC氣相色譜最常見的是紫外-可見光度計很廣范圍的非破壞性檢測器三維檢測器靈敏度可達 pg對有機化合物最常見的是 FID液相色譜分離原理 液相色譜是如何完成混合物的分離？ 混合物中各組分在固定相和流動相之間會發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離。石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱高效液相色譜儀液相色譜儀最基本的組件是高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（記錄儀、積分儀或色譜工作站）。此外，還可根據(jù)需要配置流動相在線脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動進樣系統(tǒng)、柱后反應(yīng)系統(tǒng)和全自動控制系統(tǒng)等。液相色譜儀的工作過程：輸液泵2將流動相以穩(wěn)定的流速（或

4、壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通過進樣器3將樣品導(dǎo)入,流動相將樣品帶入色譜柱4,在色譜柱中各組分因在固定相中的分配系數(shù)或吸附力大小的不同而被分離，并依次隨流動相流至檢測器5，檢測到的信號送至數(shù)據(jù)系統(tǒng)6記錄、處理或保存。高效液相色譜法的分類通常將液相色譜法按分離機理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。但在實際應(yīng)用中由于方法與應(yīng)用對象的獨特，往往采用如下一些比較固定的名稱。類 型主要分離機理主要分析對象或應(yīng)用領(lǐng)域吸附色譜吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備 分配色譜疏水分配作用各種有機化合物的分離、分析與制備凝膠色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜

5、庫侖力無機離子、有機離子分析離子排斥色譜Donnan膜平衡有機酸、氨基酸、醇、醛分析離子對色譜疏水分配作用離子性物質(zhì)分析疏水作用色譜疏水分配作用蛋白質(zhì)分離與純化手性色譜立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析高壓輸液泵基本要求流量準確可調(diào)。可控制流動相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度小于0.5%。耐高壓。要求泵的輸出壓力在30-60MPa。流動相液流穩(wěn)定。輸出的液流應(yīng)無脈動，或配套脈沖抑制器。泵的死體積小。為了快速更換溶劑和適于梯度洗脫，泵的死體積通常要求小于0.5mL。泵的結(jié)構(gòu)材料應(yīng)耐化學(xué)腐蝕。常見高壓輸液泵輸液泵一般分為恒流泵與恒

6、壓泵，恒流泵應(yīng)用更廣泛。氣動放大泵（恒壓）雙柱塞往復(fù)泵（恒流）脫氣脫氣原因流動相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進入檢測器后會在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集后會變成大氣泡，大氣泡進入流路或色譜柱中會使流動相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。氣泡一旦進入色譜柱,排出這些氣泡則很費時間。在熒光檢測中,溶解氧還會使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發(fā)生變化。方法超聲波振蕩脫氣惰性氣體鼓泡吹掃脫氣真空脫氣裝置梯度洗脫1高壓梯度： 一般只用于二元梯度，即用兩個高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀

7、態(tài)下進行混合的。高壓梯度系統(tǒng)的主要優(yōu)點是，只要通過梯度程序控制器控制每臺泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實現(xiàn)自動化控制。其主要缺點是使用了兩臺高壓輸液泵，使儀器價格變得更昂貴，故障率也相對較高，而且只能實現(xiàn)二元梯度操作。梯度洗脫2低壓梯度： 只需一個高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個比例閥，混合就在比例閥中完成。因為比例閥是在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合，在常壓下混合往往容易形成氣泡，所以低壓梯度通常配置在線脫氣裝置。來自于四種溶液瓶的四根輸液管分別與真空脫氣裝置的四條流路相接，經(jīng)脫氣后的四種溶液進入比例閥，混合后從一根輸出管進入泵體。多元梯度泵

8、的流路可以部分空置。吸附色譜1（adsorption chromatography）原理基于被測組分在固定相表面具有吸附作用，且各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產(chǎn)生保留和實現(xiàn)分離。固定相 固定相通常是活性硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑，所以吸附色譜也稱液固吸附色譜?；钚怨枘z最常用?；钚怨枘z： 一種多孔性物質(zhì),因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-結(jié)合而具有三維結(jié)構(gòu),表面具有硅羥基,作吸附劑的硅膠需經(jīng)加熱處理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔徑分布分為表面多孔和全多孔兩類。硅膠既是吸附色譜最常用的固定相，也是分配色譜、離子色譜等色譜固定相的常用基質(zhì)。吸附色譜2

9、（adsorption chromatography）流動相： 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構(gòu)烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等等。分離過程： 硅羥基呈微酸性，易與氫結(jié)合，是吸附的活性點。流動相溶劑在吸附劑表面形成單分子或雙分子吸附層，當樣品分子進入色譜柱，樣品主要靠氫鍵結(jié)合力吸附到硅羥基上，與流動相分子競爭吸附點。樣品分子反復(fù)地被吸附，又反復(fù)地被流動相分子頂替解吸，隨著流動相的流動而在柱中向前移動。因為不同的樣品分子在固定相表面的吸附能力不同，因而吸附-解吸的速度不同，各組分被洗脫的時間（保留時間）也就不同，使得各組分相互分離。應(yīng)用： 早期的H

10、PLC中應(yīng)用較多，目前主要用于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離。如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離。分配色譜1（partition chromatography）原理主要基于樣品分子在流動相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實現(xiàn)分離的液相色譜分離模式。鍵合固定相分配色譜原本是基于樣品分子在包覆于惰性載體（基質(zhì)）上的固定相液體和流動相液體之間的分配平衡的色譜方法，因此也稱液-液分配色譜。因為作固定相的液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現(xiàn)性很差，不大為人們所采用。后來發(fā)展起來的鍵合固定相以化學(xué)鍵合的方法將功能分子結(jié)合到惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。這種化學(xué)鍵合型固定相是當今HPLC

11、最常用的固定相，大約占HPLC固定相的四分之三。極性鍵合固定相鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。非極性鍵合固定相鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱，它是將十八烷基三氯硅烷通過化學(xué)反應(yīng)與硅膠表面的硅羥基結(jié)合，在硅膠表面形成化學(xué)鍵合態(tài)的十八烷基，其極性很小。正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。反相HPLC（reve

12、rsed phase HPLC）： 由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠，代表性的流動相是甲醇和乙腈。是當今液相色譜的最主要分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機物質(zhì)的分離。分配色譜2（partition chromatography）檢測器： 連續(xù)監(jiān)測柱后流出物組成與含量變化的裝置。檢測器（Detector）檢測器檢測下限選擇性梯度 主要特點 紫外-可見光10-10g/mL(下同)有可對流速和溫度變化敏感；池體積可制作得很??；對溶質(zhì)的響應(yīng)變化大。熒光10-1210-11有可選擇性和靈敏度高；易受背景熒光

13、、消光、溫度、pH和溶劑的影響。電導(dǎo)10-8有不可是離子性物質(zhì)的通用檢測器；受溫度和流速影響；不能用于有機溶劑體系。電化學(xué)10-10有困難選擇性高；易受流動相pH值和雜質(zhì)的影響；穩(wěn)定性較差。蒸發(fā)光散射10-9無可可檢測所有物質(zhì)。示差折光10-7無不可可檢測所有物質(zhì)；不適合微量分析；對溫度變化敏感質(zhì)譜10-10無可主要用于定性和半定量。原子吸收10-1310-10有可選擇性高。ICP-AES10-1010-8有可可進行多元素同時檢測。紫外-可見光（UV-VIS）檢測器原理基于Lambert-Beer定律，即被測組分對紫外光或可見光具有吸收，且吸收強度與組分濃度成正比。多數(shù)有機分子都具紫外或可見光

14、吸收基團，有較強的紫外或可見光吸收能力，因此UV-VIS檢測器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS對環(huán)境溫度、流速、流動相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。一般的液相色譜儀都配置有UV-VIS檢測器。用UV-VIS檢測時，為了得到高的靈敏度，常選擇被測物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長作檢測波長，但為了選擇性或其它目的也可適當犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長，另外，應(yīng)盡可能選擇在檢測波長下沒有背景吸收的流動相。二極管陣列檢測器（Diode-array Detector,DAD）以光電二極管陣列作為檢測元件的UV-VIS檢測器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入

15、射到陣列式接受器上的全部波長的信號，然后，對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時間、光強度和波長的三維譜圖。與普通UV-VIS檢測器不同的是，普通UV-VIS檢測器是先用單色器分光，只讓特定波長的光進入流動池。而二極管陣列UV-VIS檢測器是先讓所有波長的光都通過流動池，然后通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在接受器上被檢測。HPLC的日常維護1流動相的要求高效液相級色譜醇，二次蒸餾水，緩沖鹽一定要過濾；流動相脫氣至關(guān)重要（可采用抽濾，超聲波脫氣等方法）吸濾頭：特殊情況下可拆下濾頭抽取以判斷其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流動相通過吸濾頭打出以判斷其是否堵塞。若有堵塞情況可用異丙醇超聲波清洗；

16、清洗不成功則需要更換。單向閥：如遇到泵壓不穩(wěn)或流動相不能抽取，則可能是單向閥出現(xiàn)問題，卸下用異丙醇超聲波清洗，清洗時須按其安裝的方向放置在小燒杯中，切記不可與安裝方向倒置超洗！泵頭：泵頭漏液或出現(xiàn)其它故障一般要申請維修（如漏液，或更換柱塞桿及其密封墊等）過濾器：當色譜峰出現(xiàn)異常情況時，有可能是此部件被污染， 拆下用異丙醇超洗或更換過濾墊片。排液閥：此處不能完全密封或漏液時一般是其中的墊片污染或磨損，可卸下后取出其墊片用異丙醇超聲波清洗或更換墊圈。手動進樣器：平時應(yīng)注意用二次蒸餾水和甲醇在裝載狀態(tài)及進樣分析狀態(tài)清洗；如出現(xiàn)漏液現(xiàn)象，原因極可能為轉(zhuǎn)子密封墊磨損或污染，一般須申請維修或更換配件。流通池：在色譜峰不正常時會可能是此部件補污染?？刹鹦逗笕〕銎渲械膲|片用異丙醇超洗（可根據(jù)說明書進行操作或申請維修）。工作站：出現(xiàn)死機可重啟計算機；非正常運行時，首先可更換電腦測試硬件故障；或在本機上重新插拔接口、重新安裝軟件。手動進樣器沖洗：用備件中的針管和專用沖洗針頭對手動進樣器的裝載狀態(tài)和進樣狀態(tài)分別進行沖洗3-4ml的蒸餾水，然后再沖洗3-4ml的純甲醇。HPLC的日常維護2HPLC的日常維護3泵頭沖洗：用備件中的針頭和針管分別用蒸餾水和純甲醇沖洗3-5ml。緩沖鹽的使用：流動相含有鹽分時，做完實