重組導入受體細胞 (2)PPT

1、關(guān)于重組導入受體細胞 (2)第一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 重組DNA導入受體細胞 按 DNA片段連接重組的方法，目的基因與載體連接后成為重組 DNA 分子。而重組 DNA分子只有進入適宜的受體細胞后才能進行大量的擴增和有效的表達。目的基因能否有效地進入受體細胞，除了選用上述合適的克隆載體外，還取決于選用的受體細胞和轉(zhuǎn)移方法。一、受體細胞二、重組DNA導入受體細胞的途徑第二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一、受體細胞1. 受體細胞的定義與選擇原則2. 受體細胞的類型第三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 受體細胞的定義與選擇原則（1）受體細胞指能夠攝

2、取外源DNA（基因）并使其穩(wěn)定遺傳的細胞。作為基因工程的受體細胞，從實驗技術(shù)上講是能攝取外源 DNA(基因)，并使其穩(wěn)定維持的細胞；從實驗目的上講是有應(yīng)用價值或理論研究價值的細胞。原核生物細胞和真核生物細胞可作為受體細胞，但不是所有細胞都可以作為受體細胞。在目的基因與載體連接成重組DNA分子以后，下面的重要工作主要是將其導入受體細胞進行擴增和篩選，獲得大量的重組DNA分子，這就是外源基因的無性繁殖，即克隆(cloning)。 第四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）受體細胞的選擇原則據(jù)所用載體體系及受體細胞的基因型進行選擇；重組體的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染率高；能夠穩(wěn)定遺傳；受體細胞基因型與載體

3、所含的選擇標記匹配；易于篩選重組體；外源基因可以高效表達和穩(wěn)定遺傳；此外，安全性、導入方法、翻譯及后加工機制和生產(chǎn)應(yīng)用價值等。第五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 受體細胞的類型（1）微生物表達系統(tǒng)（是較為理想的受體細胞）優(yōu)點： 無纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源 DNA 進入；無核膜，外源DNA 與裸露的染色體 DNA 重組簡單；基因組小，便于對引入的外源基因進行遺傳分析；容易獲得一致性的實驗材料，培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。第六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 受體細胞的類型（1）微生物表達系統(tǒng)缺點：缺乏蛋白質(zhì)的修飾作用，故微生物細胞不能直接表達

4、真核生物基因，但可以通過對真核生物基因進行適當?shù)男揎椈虿捎胏DNA克隆而加以改進。第七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 受體細胞的類型（1）微生物表達系統(tǒng)常用微生物表達系統(tǒng)：大腸桿菌枯草桿菌藍細菌棒狀桿菌和鏈霉菌酵母菌第八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌優(yōu)勢：全基因組測序共有4405個開放型閱讀框架；克隆表達系統(tǒng)成熟完善，繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、遺傳穩(wěn)定，曾被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物，現(xiàn)已用來生產(chǎn)人胰島素、生長素及干擾素等。劣勢：缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復制、修飾后加工功能；內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，含有種類繁多的內(nèi)毒素。第九張，PPT共

5、八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月枯草桿菌亦稱枯草芽孢桿菌。優(yōu)勢： 具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因，能將基因表達產(chǎn)物高效的分泌到培養(yǎng)基中，簡化了加工提取工藝，所分泌的真核基因產(chǎn)物具有天然構(gòu)象和生物活性；不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無致病性；具有芽孢形成能力，易于保存和培養(yǎng)，代謝易控制。成功表達了-干擾素、白細胞介素、乙肝病毒核心抗原及淀粉酶、高溫脂肪酶等。劣勢：產(chǎn)物易被自身分泌的蛋白酶分解，而且重組體穩(wěn)定性差。第十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月藍細菌亦稱藍藻，與細菌親緣關(guān)系密切。優(yōu)勢：自養(yǎng)型，嫩能夠進行光合作用釋放氧氣，培養(yǎng)簡單易行，可能成為植物基因表達的宿主。現(xiàn)已獲得了高效表達的PHB等產(chǎn)物的藍藻工程菌（

6、用于生產(chǎn)可降解塑料），作為生物反應(yīng)器，大量生產(chǎn)藥物、燃料等具有應(yīng)用價值的產(chǎn)品。第十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月棒狀桿菌和鏈霉菌用于生產(chǎn)氨基酸和抗生素等產(chǎn)品。第十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母菌是以芽殖或裂殖進行無性繁殖的單細胞真核生物。優(yōu)勢：除了真核生物細胞共有的特性外，還具有以下優(yōu)點：基因結(jié)構(gòu)相對比較簡單，對其基因表達調(diào)控機制研究得比較清楚，便于基因工程操作；培養(yǎng)簡單，適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉；外源基因表達產(chǎn)物能分泌到培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工；不產(chǎn)生毒素，是安全的受體細胞。 第十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）植物表達系統(tǒng)主要是利

7、用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染的方法將目的基因?qū)?，多用于雙子葉植物。最突出的優(yōu)點：體細胞的全能性，即一個分離的活細胞在合適的培養(yǎng)條件下，比較容易再分化成植株，這意味著一個獲得外源基因的體細胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。第十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）植物表達系統(tǒng)不足之處：植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組 DNA 分子?？朔椒ǎ豪w維素酶處理獲得原生質(zhì)體，采用農(nóng)桿菌介導法或用基因槍、電激儀處理等方法，同樣可使外源 DNA進入植物細胞。第十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）動物細胞表達系統(tǒng)主要用于大規(guī)模的表達天然狀態(tài)的復雜蛋白質(zhì)或動物疫苗、動物品種遺

8、傳改良及人類基因的遺傳治療等。昆蟲細胞：能表達原核基因和哺乳動物基因，具有較強的分泌能力和修飾能力，但糖基化的寡糖鏈與人類糖蛋白的相差較大，多用于抗體生產(chǎn)。哺乳動物細胞：具有很強的蛋白質(zhì)修飾能力，基因產(chǎn)物分泌能力強，有很強的遺傳穩(wěn)定性和可重復性，但組培條件要求苛刻，易污染，成本高。第十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月二、重組DNA導入受體細胞的途徑轉(zhuǎn)化：transfermation，通過生物學或理化方法使質(zhì)粒DNA或以質(zhì)粒DNA為載體構(gòu)建的重組DNA導入受體細胞內(nèi)，并在受體內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程，主要用于原核生物。轉(zhuǎn)染：transfection，是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式，指病毒或以病毒

9、為載體構(gòu)建的重組DNA導入受體細胞，并使宿主遺傳性狀發(fā)生改變的過程，其中包括DNA、RT-DNA及RNAi，主要用于原核生物。第十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 重組DNA導入宿主細胞的類型轉(zhuǎn)導:( transduction ) 以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導入受體細胞的過程。 第十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 直接轉(zhuǎn)化法有的微生物細胞在不加任何處理的情況下就能直接攝取外源 DNA，只要外源 DNA與這樣的細胞混合，在適宜的條件下懸浮培養(yǎng)，就能完成外源 DNA 的轉(zhuǎn)化。細菌轉(zhuǎn)化 ：指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生

10、命過程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫給體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株叫受體菌株。第十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 大腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體細胞。 通常采用的是大腸桿菌的感受態(tài)細胞，即在冰浴中用一定濃度的CaCl2處理對數(shù)生長期的大腸桿菌，以獲得高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亞礬、二硫蘇糖醇(DTT)或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細胞。感受態(tài)細胞(competent cell):具有易于接受外源DNA能力的細胞。 感受態(tài)：是指受體細胞能吸收外源DNA分子而有效地作為轉(zhuǎn)化受體的某些生理狀態(tài)。一般受體細胞在對數(shù)生長期轉(zhuǎn)化能力最強。第二十張，PP

11、T共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月本質(zhì)兩種假說一局部原生質(zhì)體化假說：細菌表面的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，使DNA分子能夠通過質(zhì)膜進入細胞二酶受體假說：感受態(tài)細胞表面形成一種能夠接受DNA的酶切位點，使DNA分子能夠進入細胞第二十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌接種于瓊脂培養(yǎng)基37培養(yǎng)基(一) 感受態(tài)細胞的制備： 1、從新活化的E.coli DH5平板上挑取一單菌落，接種于35ml LB液體培養(yǎng)中，37振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(12h左右)； 2、將該菌懸液以1:1001:50轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩擴大培養(yǎng)，當培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后

12、，每隔2030min測一次OD600，至OD600為0.30.5時停止培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到1.5 mL離心管中； 3、培養(yǎng)物于冰上放置20min； 4、 04，4000g離心10min，棄去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細胞, 冰浴20分鐘；感受態(tài)細胞制備Preparation of competent cell第二十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 5、04， 4000g離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液輕輕懸浮細胞，冰浴20min； 6、 04， 4000g離心10min，棄去上清液，加入100 L

13、冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心懸浮細胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細胞懸液； 7、制備好的感受態(tài)細胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實驗，如果在4放置1224h，其轉(zhuǎn)化效率可以增高46倍；也可加入占總體積15左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70條件下，可保存半年至一年。第二十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月注意事項1細菌的生長狀態(tài)：實驗中應(yīng)密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時細胞密度是5107/ml）；2 所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進行；3 經(jīng)CaCl2處理的細胞，在低溫

14、條件下，一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加，24h達到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的）；4 化合物及無機離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子（如Mn 2+或Co 2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；第二十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月5 所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質(zhì)的存在可能大大降低細菌的轉(zhuǎn)化效率；6 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA；7 一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；第二十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.

15、高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法 （1）Electroproration原理：利用高壓電脈沖作用，使細胞膜上產(chǎn)生可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA和高分子物質(zhì)進入細胞質(zhì)內(nèi)而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化，但不傷及細胞，切斷電場后，被擊穿的膜孔可以自行恢復。（2）過程：把宿主細胞置于外加電場中，通過電脈沖作用在細胞膜上打孔，DNA分子進入細胞。第二十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法（3）條件：電壓300600V、時間20100ms、溫度0。（4）適用范圍：酵母菌、霉菌等真核生物，適用于農(nóng)桿菌感染不敏感的植物。（5）形式：電穿孔 第二十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月例如：高壓電穿孔法

16、轉(zhuǎn)化細菌對數(shù)生長期的細菌冷卻離心低鹽緩沖液清洗用10%甘油懸浮細胞干冰速凍-70貯存外加電場（300-600V維持20100ms）電脈沖轉(zhuǎn)化細胞0-4 第二十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 微彈轟擊轉(zhuǎn)化法（microprojectile bombardment,particle bombardment ）該法亦稱基因槍法(particle gun)，粒子轟擊法，生物彈法（Biolistics）。（1）原理：金屬微粒在外力作用下，達到一定速度后，將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨金屬顆粒一起進入植物細胞，但又不引起細胞致命傷害而維持正常的生命活動。（2）過程：外源DNA與鎢

17、、金等金屬微?；旌?，使DNA吸附在微粒表面；用基因槍轟擊，通過氦氣沖擊波使DNA隨金屬微粒進入植物細胞。第二十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月基因槍介導的DNA轉(zhuǎn)移基因槍法最早是由美國康奈爾大學的Sanford(1987)最先提出的。它通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導入到受體細胞內(nèi)，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過該法獲得的。第三十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一類是以火藥爆炸力作為動力加速微彈；第二類是以高壓氣體(high pressure gas)作為動力，如以氦氣、氫氣、氮氣等。其工作原理是把載有DNA的鎢(金)粉噴灑

18、在一張微粒載片上，電極間懸滴著微水滴。在壓縮空氣的沖擊下，微水滴霧狀噴射，驅(qū)動載片。當載片受阻于金屬篩網(wǎng)時,載有DNA的鎢(金)粒繼續(xù)向下沖擊射入細胞。第三十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 第三類是以高壓放電為驅(qū)動力。其最大優(yōu)點是可以無級調(diào)速，通過變化工作電壓，粒子速度及射入濃度可準確控制，使載有DNA的鎢(金)粉粒子能到達具有再生能力的細胞層。這一點非常重要，因為不同的外植體需要不同的參數(shù)。采用該放電轟擊、已在大豆和水稻上成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株(Christou等，1992)第三

19、十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA微粒載體的制備原理是CaCl2對DNA沉淀作用，亞精胺、聚乙二醇具有粘附作用、將這些化合物與DNA混合后與鎢粉或金粉混合，吹干后，則DNA沉淀在載體顆粒上第三十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月步驟(1)DNA微彈的制備 1)微粒體的洗滌取60-100mg鎢粉或金粉，其微粒直徑最好選擇為細胞直徑的1/10，并溶于1ml無水乙醇中，用超聲

20、波振蕩洗滌。微粒體處理后可在密閉條件下，室溫貯存1周。離心盡量除去乙醇。加1ml無菌水振蕩離心，移去上清液，如此重復2次，將殘留的乙醇除凈，再用1ml無菌水重懸沉淀，密閉貯存于室溫中，備用，保存時間不要超過1周。第四十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2)DNA微粒載體的制備上述微粒貯存液離心移去上清液，加1ml無菌水重懸；每份樣品取25l微粒重懸液，加入25 l DNA(1 g/ l)，手指振蕩3次，充分混勻； 加入25l2.5mol/LCaCl2溶液，手指振蕩5次；加入20l40PEG 4000，手指振蕩5次；加入2.5ml0.1mol/L亞精胺，手指振蕩5次；混合液在室溫靜置10

21、min，使DNA沉淀到微粒體上；離心5min，移去50-60l上清液(嚴格掌握體積，使剩余溶液量可以進行3次槍擊)；制備好的DNA微粒載體，可在冰水中保存，但不能超過4個小時，槍擊時每次取樣8l。 注意：上述制備過程均在無菌條件下操作。第四十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 3)靶外植體材料準備在無菌條件下截取靶外植體(有菌的外植體按常規(guī)方法消毒處理)，放于樣品皿中，外植體大小按基因槍要求選擇；在無菌條件下，把靶外植體放入基因槍的樣品室，并對準子彈發(fā)射軸心。 4)DNA微彈轟擊，按照不同的基因槍說明書操作。 5)轟擊后外植體的培養(yǎng)。DNA微彈轟擊后立刻轉(zhuǎn)入相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以免材

22、料脫水加重細胞受傷害的程度，獲得再生植株。第四十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 轉(zhuǎn)化率及其影響因素關(guān)于基因槍法的轉(zhuǎn)化率，目前不同的作者報告差別很大，不同的植物、同一植物的不同外植體均有明顯差異。一般在10-4-10-2頻率范圍。第四十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月影響轉(zhuǎn)化率的因素：1)金屬微粒的影響 目前主要采用兩種金屬微粒作為DNA包裹的載體：一種是鎢粉，其微粒直徑可根據(jù)不同植物材料進行選擇，一般以0.6m至4m為宜，其優(yōu)點是廉價易得，制備容易。金粉顆粒，其比鎢粒具有更規(guī)則的球形體積，可以在相同體積下取得最大的附著面積；化學性質(zhì)也更為穩(wěn)定，也不像鎢粒那樣形成氧化膜

23、。此外，金粉對DNA的吸附力更強，許多學者認為金粉比鎢粉更理想，但金粉價格昂貴，仍然應(yīng)用較少。第四十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 (2)DNA沉淀輔助劑的影響 目前常用的DNA沉淀輔助劑有CaCl2、亞精胺、聚乙二醇等。這些化合物的濃度不僅對DNA在鎢(金)粉上的粘附有重要影響，而且對植物受體細胞的傷害也至關(guān)重要。 (3)DNA的純度及濃度對轉(zhuǎn)化率的影響 DNA的純度越高越容易獲得成功的轉(zhuǎn)化，加入攜帶DNA如4-6kb的小牛胸腺DNA及鮭魚精DNA?？商岣咿D(zhuǎn)化率、但混雜的DNA起干擾作用。DNA的濃度對微彈轉(zhuǎn)化率也有影響。 (4)微彈速度的影響 基因槍的轟擊參數(shù)，DNA粒子速度

24、、入射濃度、阻擋板至樣品室高度、轟擊次數(shù)等均影響轉(zhuǎn)化率，其中微彈的速度是影響轉(zhuǎn)比率的一個重要因素。它直接決定了微彈對細胞、組織的作用力及產(chǎn)生損傷的程度 不同的植物材料、不同的轉(zhuǎn)化要求，應(yīng)選擇不同的速度。第四十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月特點無宿主限制：單子葉和雙子葉植物適用，動物、微生物也適用靶受體類型廣泛：原生質(zhì)體、葉圓片、愈傷組織、懸浮液細胞、莖段、胚、花粉可控度高；高壓氣體基因槍已可根據(jù)實驗需要無級調(diào)控微彈的速度和射入濃度，可以較高的命中率把DNA微粒載體射入特定層次的細胞從而為基因轉(zhuǎn)化提供可靠的技術(shù)措施。操作簡便快速，甚至可克服無菌的困難。第四十六張，PPT共八十九頁，

25、創(chuàng)作于2022年6月 不少問題值得進一步研究例如，轉(zhuǎn)化頻率低，目前大多數(shù)只報道轉(zhuǎn)化后的瞬時表達，而穩(wěn)定遺傳的比例甚差，外源DNA的整合機理等理論問題也不清楚、應(yīng)該說基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)只處在研究階段，尚未成熱。第四十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 微彈轟擊轉(zhuǎn)化法（3）適用范圍：植物細胞。（4）特點：操作簡單，轉(zhuǎn)化率高，省去了分離原生質(zhì)體的麻煩，耗資較大。第四十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 顯微注射法（microinjection）（1）原理：利用顯微注射儀，通過機械方法把外源DNA直接注入細胞質(zhì)或細胞核（需用特制的玻璃微管）。倒置顯微注射儀第四十九張，PPT共八

26、十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 顯微注射法（2）過程：將外源基因直接注入實驗動物受精卵原核，外源基因整合到動物基因組，通過胚胎移植把含有外源基因的受精卵移植到受體子宮并發(fā)育。（3）適用范圍：真核生物，早期用于動物，現(xiàn)已應(yīng)用于植物。（4）特點：繁瑣耗時、轉(zhuǎn)化率高，但需專門的顯微注射儀，且要求操作者有精細的操作技術(shù)和低密度細胞培養(yǎng)技術(shù)。第五十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月受體細胞的固定動物細胞具有獨特的貼壁生長待性，不存在固定細胞的問題植物細胞必須先建立細胞固定技術(shù)目前有三種方法：第五十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月瓊脂

27、糖包埋法：把低熔點的瓊脂糖熔化，冷卻到一定溫度后將制備的細胞懸浮液混合于瓊脂糖中。需要注意的問題是，在包埋時細胞約1/3-1/2暴露在瓊脂糖表面，即細胞體的一半埋在瓊脂糖中，起固定作用，暴露的一半細胞可一進行微針注射、否則瓊脂固化后很難進行。多聚-L-賴氨酸粘連法：先用多聚-L-賴氨酸處理玻片表面，由于聚賴氨酸對細胞有粘連作用，因此當分離的細胞或原生質(zhì)體與玻片接觸時被固定在玻片上。而且一個破片上可固定較多數(shù)量的細胞或原生質(zhì)體。第五十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月吸管支持法：用一固定的毛細管將原生質(zhì)體或細胞吸著在管口起到固定作用，然后再用微針進行DNA注射。這種方法的優(yōu)點是吸管可以

28、旋轉(zhuǎn)或移動位置使操作者能選擇最佳位置進行注射。 顯微注射用的微針通常用拉針機制備，尖針直徑以0.5m左右為宜。一次注入細胞質(zhì)中的DNA量約為10-9ml。第五十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)化率及影響因素 顯微注射雖然操作繁瑣耗時，但其轉(zhuǎn)化效率很高已發(fā)展出一套完善的技術(shù)，在煙草、油菜、苜蓿等植物的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率高達60以上。影響轉(zhuǎn)化率的因素。(1)原生質(zhì)體的成活率是轉(zhuǎn)化率的重要因素，只有注射那些能夠分裂、成活的原生質(zhì)體才能得到轉(zhuǎn)化。因此，注射時要選擇啟動分裂、細胞壁開始形成的原生質(zhì)體進行注射。 (2)線性DNA比環(huán)形DNA具有更高的轉(zhuǎn)化率。 (3)操作要迅速敏捷，選擇最佳的注射

29、強力和濃度，使細胞的損傷減少到最小程度。 (4)固定技術(shù)要可靠，不能損傷細胞。第五十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月顯微注射特點方法簡單、轉(zhuǎn)化率高；6-8%它是一種純粹的物理方法，適用于各種植物和各種材料，無局限性；整個操作過程對受體細胞無藥物等毒害，有利于轉(zhuǎn)化細胞的生長發(fā)育；轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)過程無需特殊的選擇系統(tǒng)。其缺點是需要有精細操作的技術(shù)及低密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)，注射速度慢、效率低，要求研究者有耐心。第五十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月6. 脂質(zhì)體（liposome）介導法（1）原理：受體細胞的細胞膜表面帶負電荷，脂質(zhì)體顆粒帶正電荷，利用引力的作用把遺傳物質(zhì)導入細胞內(nèi)。

30、即用脂類化學物質(zhì)包裹DNA成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞噬或融合作用把內(nèi)含物轉(zhuǎn)入受體細胞。脂質(zhì)體是根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)功能特性合成生物膜，然后把DNA包裹在人工膜內(nèi)。 第五十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月6. 脂質(zhì)體介導法（2）過程：在形成脂質(zhì)體時，把用來轉(zhuǎn)染的目的DNA分子包裹在其中；脂質(zhì)體與細胞接觸；外源DNA分子導入受體細胞。（3）適用范圍：真核細胞。（4）特點：包在脂質(zhì)體內(nèi)的 DNA可免受細胞內(nèi)核酸酶的降解，所以可直接轉(zhuǎn)化外源 DNA；對植物病毒RNA的轉(zhuǎn)化率高；如用PEG誘導脂質(zhì)體與原生質(zhì)體融合可獲得高的轉(zhuǎn)化率。4 10-5第

31、五十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 影響脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化率的因素很多：脂質(zhì)體的制備類型、方法均有明顯差異；PEG的濃度、加入時間、PH值及ca”濃度均起到重要作用；保溫培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化時的條件同樣十分重要。第六十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 近年來美國BRL公司推小一種新型脂質(zhì)體即轉(zhuǎn)化脂(1ipofectia，它主要是由具有強電荷的N-1-(2，3-dioleyoxy)propylN，N，N，trimethylammonium chloride(DOTMA)-(N-1-(2，3二油酰)丙酰N，N，N三甲氨鹽酸鹽)和磷酯組成的小單層脂質(zhì)體(SUV)。借助于DOTMA的強正電荷，可

32、以與帶有負電荷的DNA分子自發(fā)地結(jié)合，只要把轉(zhuǎn)化脂與DNA簡單地混合，即可形成轉(zhuǎn)化脂與DNA的復合體，把DNA包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，并可有效地轉(zhuǎn)化動植物細胞。此方法不僅可明顯提高轉(zhuǎn)化率，而且由于這種脂質(zhì)體有商品出售，免去耗時的制備上作，操作簡便，反應(yīng)條件溫和。朱禎等1990年首次利用此脂質(zhì)體將人的干擾素cDNA導入水稻原生質(zhì)體獲得轉(zhuǎn)基因植株，并檢測了干擾素在水稻細胞中的有效表達轉(zhuǎn)化頻率提高到14。第六十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月7. 花粉管通道法（1）原理：在花粉管通道形成之后封閉之前一段時間，使外源DNA能沿著花粉管通道進入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具正常細胞壁的卵細胞、合子或早期胚胎細胞，

33、從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。（2）適用范圍：植物第六十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月7. 花粉管通道法（3）特點：直接得到轉(zhuǎn)化種子，不經(jīng)過組培，減少了基因型的影響；操作簡單經(jīng)濟，無需昂貴儀器和化學藥品，可直接在大田操作；大量快捷，性狀穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高；可獲得110-2110-1的高遺傳轉(zhuǎn)化率。 不僅可以導入供體的總DNA，而且可導入含目的基因的質(zhì)粒，甚至可將化學誘變劑導入胚囊。缺點：工作時間受自然花期限制，田間操作受環(huán)境影響大，基因組以隨機方式結(jié)合，要求工作人員經(jīng)濟性要強，工作效率較低。第六十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月我國科學家周光宇在1983年首次在“Methods i

34、n En-zymology”報道的研究成果?，F(xiàn)該技術(shù)主要在蔬菜育種上應(yīng)用。（白菜、茄子、黃瓜、番茄、辣椒等操作步驟1.外源DNA的制備2. 分析受體植物的受精過程及時間，確定導入外源DNA的時間方法（3種） 柱頭涂抹法 柱頭切除法 花粉粒吸入法3.后代材料處理第六十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月9. 激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法 早在1984年Tao等首先利用激光微束對動物細胞進行DNA轉(zhuǎn)化試驗、此庸Web等利用激光微束技術(shù)對原生質(zhì)體、花粉以及活細胞內(nèi)的葉綠體進行外源DNA導入獲得成功，并用熒光標記的大腸桿菌pBR322質(zhì)粒DNA在轉(zhuǎn)化細胞中得到檢測。（1）原理：利用直徑很小、能量很高的激

35、光微束能引起細胞膜可逆性穿孔的原理。在熒光顯微鏡下找適合的細胞，然后用激光代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔外于細胞周圍的外源DNA分子隨之進入受體細胞。第六十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月9. 激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法（2）特點：操作簡便快捷，轉(zhuǎn)化效率高10-3-10-4，無宿主限制，但需要貴重儀器，技術(shù)條件要求高，穩(wěn)定性和安全性不如電穿孔法和基因槍法。（3）適用范圍：動植物細胞、組織、器官及線粒體、葉綠體。第六十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月過程1）DNA的提取2)受體植物樣品制備：將欲照射的植物細胞或組織用高滲緩沖液浸泡數(shù)分鐘，不同作物不同外植體所用高

36、滲液不同，浸泡時間也不同。 3)轉(zhuǎn)導細胞懸浮液準備：激光照射前洗去高滲液，加新鮮培養(yǎng)液。吸取0.5mI細胞懸浮液，加50ul質(zhì)粒DNA或植物外源DNA(濃度5ugml)一起注入激光微束系統(tǒng)的Rose小室。第六十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4)激光微束照射：激光微束顯微照射裝置如為NdYAG四集倍頻脈沖激光冠微照射系統(tǒng)、即輸出波長技需要選擇，脈寬10-15ns。激光束引入一臺相差顯微鏡，用40物鏡聚焦Y于欲照射的細胞。光斑直徑為1.3nm。照射時移動載物臺，使激光脈沖在植物細胞團上進行掃描照射，照射時間每個佯品60分鐘，約打7000個脈沖。 5)培養(yǎng)：激光照射后，將樣品用新鮮的培

37、養(yǎng)液沖洗1-2次，然后接種在裝有液體培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中，25度條件下懸浮培養(yǎng)2-3天或固體培養(yǎng)。第六十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月10. 病毒顆粒轉(zhuǎn)導法（1）原理：用病毒(噬菌體)DNA(或 RT-DNA)構(gòu)建的克隆載體或攜帶目的基因的克隆體，在體外包裝成病毒(噬菌體)顆粒后，感染受體細胞，使其攜帶的重組 DNA 進入受體細胞，將此過程稱為病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導法。（2）適用范圍：主要用于構(gòu)建基因文庫和物的轉(zhuǎn)基因，早期也用于植物的轉(zhuǎn)基因。 第七十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月10. 病毒顆粒轉(zhuǎn)導法（3）類型：帶有目的

38、基因的病毒顆粒直接感染受體細胞，目的基因打隨同病毒DNA分子整合到受體細胞染色體DNA上，這樣以后不需要再包裝成病毒顆粒。帶有目的基因的病毒是缺陷型的，需同另一輔助病毒一起感染受體細胞，在受體細胞內(nèi)包裝成新的病毒顆粒。雖然帶有目的基因的SV40早期轉(zhuǎn)錄是缺陷型的，但被感染的cos細胞系的基因組中整合的SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段DNA，所以無需輔助病毒做混合感染。第七十一張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月11. 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法（1）原理：哺乳動物細胞能捕獲黏附在細胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細胞。（2）基本操作過程：將待轉(zhuǎn)染的外源 DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，

39、逐滴加入到不斷攪拌的Hepers-磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀復合物；用吸管將沉淀復合物黏附在哺乳動物單層培養(yǎng)細胞表面；保溫幾小時后，用新鮮培養(yǎng)液洗凈細胞，再用新鮮培養(yǎng)茹繼續(xù)培養(yǎng)，直至外源基因表達。第七十二張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月11. 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法（3）特點：多使用高濃度的DNA，1050g/ml；保溫時間隨受體細胞而異；Hepers-磷酸鈣溶液應(yīng)不斷攪拌，DNA溶液則應(yīng)緩慢加入，否則形成大塊狀顆粒，不利于受體細胞吸納。（4）適用范圍：哺乳動物細胞。第七十三張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月12. DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法即二乙胺乙基葡聚糖法（1）可能機制：

40、DEAE葡聚糖能與外源DNA形成復合物，保護DNA免受核酸降解 DEAE葡聚糖可作用于受體細胞，增加其通透性，便于DNA進入。（2）類型：病毒DNA直接與DEAE-葡聚糖混合形成復合物，再處理受體細胞；受體細胞先用DEAE-葡聚糖處理，然后再接觸DNA。（3）特點：方法簡單，重復性高，轉(zhuǎn)染率高于磷酸鈣法，但轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞不能獲得穩(wěn)定的細胞系，故僅適用于基因瞬時表達研究。（4）適用范圍：哺乳動物細胞 第七十四張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月13. 聚陽離子DMSO轉(zhuǎn)染法（1）原理：采用聚陽離子poly-brene處理哺乳動物細胞，以增加細胞表面對DNA的吸附能力，然后用25%30%D

41、MSO短暫處理細胞，增加膜的通透性，以提高對外源DNA的捕獲量（2）適用范圍：哺乳動物細胞第七十五張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月14. 農(nóng)桿菌介導Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法（1）原理：植物受傷后，在傷口處分泌大量的酚類物質(zhì)如乙酰丁香酮AS、羥基乙酰丁香酮等，他們是農(nóng)桿菌識別敏感植物的信號分子，趨化性農(nóng)桿菌移向這些細胞，并將其Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)部，故目的基因與Ti質(zhì)粒結(jié)合后，通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入植物細胞，與染色體DNA整合而得以穩(wěn)定維持或表達。第七十六張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月外植體（子葉、上胚軸、莖段、愈傷組織）胚 狀 體轉(zhuǎn)基因檢測（GUS、PCR ）進一步檢

42、測（ Southern blot 、 Northern blot、ELISA）LB繁殖菌體農(nóng)桿菌（Ti或Ri質(zhì)粒）轉(zhuǎn) 基 因 植 株田間實驗、遺傳分析、功能鑒定侵 染 轉(zhuǎn) 化愈 傷 組 織共 培 養(yǎng)芽誘導生根 （試管嫁接）預 培 養(yǎng)農(nóng)桿菌介導法第七十七張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月農(nóng)桿菌介導法 （一）農(nóng)桿菌包括農(nóng)桿菌包括根癌農(nóng)桿菌（Ti質(zhì)粒）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Ri質(zhì)粒），質(zhì)粒中含有一段可移動的DNA稱為T-DNA，可作為外源DNA的載體。 （二）根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞的過程大致包括：1、農(nóng)桿菌對植物細胞表面特定部位的識別和附著；2、經(jīng)敏感細胞的誘導作用，位于Ti質(zhì)粒上控制T區(qū)的基因轉(zhuǎn)移的Vir區(qū)基因活化并表達；3、T-DNA從Ti質(zhì)粒上切割下來，通過細菌和植物細胞的壁，轉(zhuǎn)移并整合到植物細胞的核基因組中。第七十八張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月14. 農(nóng)桿菌介導Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法（2）類型： 整株感染：對數(shù)生長期的野生農(nóng)桿菌感染植物細胞的受傷部位，將得到的腫瘤或發(fā)根切下，至于含羧芐青霉素的無激素培養(yǎng)基上培養(yǎng)并殺菌，這是獲得轉(zhuǎn)化細胞的最簡單的方。該法實驗周期短，操作簡便，但在用轉(zhuǎn)化后形成的腫瘤組織時，常會有未轉(zhuǎn)化的正常細胞，即形成的是嵌合體植株。第七十九張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十張，PPT共八十九頁，創(chuàng)作于202