結(jié)核桿菌H37Ra免疫小鼠后脾淋巴細(xì)胞的殺傷活性及免疫機(jī)制的研究

1、結(jié)核桿菌H37Ra免疫小鼠后脾淋巴細(xì)胞的殺傷活性及免疫機(jī)制的研究王利嫻,盧賢瑜,李惠,陽強(qiáng)【關(guān)鍵詞】結(jié)核桿菌H37Ra;,Ag85B卵白;,小鼠淋巴細(xì)胞;,穿孔素;,顆粒酶BStudyntheyttxiityfspleenlyphytesandiuneehanissinieiunizedbyybateriutuberulsisH37RaAbstratAI:TexplrethespeifiyttxiityfspleenlyphytesandtheiuneehanissinieiunizedbyybateriutuberulsisTBH37Ra.ETHDS:Atthevariusinterval(

2、30days,60days)aftertheieereiunizedbyTBH37Ra,BGandPBS,thespleenlyphytesftheiunizedieereusedastheeffetrellshiletheSp2/0ellsexpressingtheseretedprtEinAg85Bereusedasthetargetells,andtheyttxiityfspleenlyphytesintheiunizedieaseasuredbyTTassay.Spleenlyphyteserelletedat60daysafteriunizatinandstiulatedithPPD

3、,andtheexpressinfperfrin,granzyeBnRNAlevelasdetetedbyRTPR.RESULTS:TheyttxiityfspleenlyphytesinthegrupiunizedbyTBH37RaassignifiantlyhigherthanthatfPBSntrlgrup(P005),andslightlyhigherthanthatfBGgrup.TheRNAexpressinfperfrin,granzyeBinH37RagrupandBGgrupassignifiantlyhigherthanthatinPBSntrlgrup(P005);the

4、expressinfperfrinRNAinH37RagrupassignifiantlyhigherthanthatinBGgrup(P005),butthereasnbviusdiffereneithregardttheexpressinfgranzyeBRNAbeteenH37RagrupandBGgrup.NLUSIN:TheyttxiityfspleenlyphytesisenhanedafterieereiunizedbyTBH37Ra,hihayberelatedttheexpressinfperfrinandgranzyeB.KeyrdsTBH37Ra;Ag85Bprtein;

5、spleenlyphyte;perfrin;granzyeB摘要目的:探究結(jié)核桿菌H37Ra免疫小鼠后,產(chǎn)生特異性的脾淋巴細(xì)胞殺傷活性及其免疫機(jī)制。要領(lǐng):(1)別離以結(jié)核桿菌H37Ra、BG和PBS免疫小鼠后第30天及第60天,分散各組小鼠脾淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,以表達(dá)Ag85B排泄卵白的Sp2/0細(xì)胞為靶細(xì)胞,用TT比色法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的殺傷率;(2)在免疫后第60天,小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)PPD刺激后,以RTPR法檢測穿孔素RNA及顆粒酶BRNA的表達(dá)。結(jié)果:(1)結(jié)核桿菌H37Ra組脾淋巴細(xì)胞的殺傷率顯著高于PBS比擬組(P0.05),略高于BG組;(2)H37Ra組和BG組穿孔素、顆

6、粒酶RNA的表達(dá)量均明顯高于PBS組P0.05,H37Ra組穿孔素RNA的表達(dá)量明顯高于BG組(P0.05),但顆粒酶BRNA的表達(dá)量兩組無差異。結(jié)論:結(jié)核桿菌H37Ra免疫小鼠后,能加強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞的殺傷活性,其機(jī)制大概與增長穿孔素、顆粒酶B的表達(dá)有關(guān)。關(guān)鍵詞結(jié)核桿菌H37Ra;Ag85B卵白;小鼠淋巴細(xì)胞;穿孔素;顆粒酶B比年來,由于生齒活動的增長,多重耐藥菌株的盛行,以及結(jié)核分枝桿菌TB和HIV的雙重熏染,導(dǎo)致TB的發(fā)病率和殞命率大副度進(jìn)步。而如今惟一獲準(zhǔn)利用的卡介苗BG的防范結(jié)果又不甚抱負(fù),對差異的人群庇護(hù)力差異較大,因此,天下各國加強(qiáng)了對宿主對抗結(jié)核桿菌免疫機(jī)制的研究。H37Ra是由H

7、37Rv人型結(jié)核分枝桿菌尺度毒株屢次傳代后得到的無毒株。國表里文獻(xiàn)報(bào)道,H37Ra具有毒力較低、抗原性完備1,2及能充實(shí)活化巨噬細(xì)胞3,4等長處,因此,結(jié)核桿菌H37Ra作為侯選減毒活疫苗具有相對的上風(fēng)。然而怎樣進(jìn)步D8+T細(xì)胞的特異性殺傷活性,是研制新型抗結(jié)核疫苗急迫必要思量的題目。以往結(jié)核疫苗的研究中,有關(guān)特異性小鼠脾淋巴細(xì)胞殺傷作用的研究較比菲薄。Ag85B是結(jié)核分枝桿菌的重要排泄卵白,可誘發(fā)對TB的庇護(hù)性免疫應(yīng)答。本研究中擬用能表達(dá)此目的卵白的Sp2/0細(xì)胞為靶細(xì)胞,檢測結(jié)核桿菌H37Ra免疫小鼠后,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性脾淋巴細(xì)胞殺傷活性的結(jié)果,并從分子程度上檢測穿孔素、顆粒酶RNA的表

8、達(dá),以探究小鼠脾淋巴細(xì)胞抗TB熏染的免疫機(jī)制。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料攜帶有Ag85B排泄卵白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pTB30,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院微生物教研室范雄林博士奉送,本室保存。結(jié)核桿菌H37Ra、BG菌株由本室保存。Sp2/0細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)熏抱病研究所提供。Lipfetaine2000購自美國Invitrgen公司?？俁NA提取試劑Trizl購自上海生工公司。RTPR試劑盒購自TaKaRa公司。PPD尺度品購自成都市生物成品研究所?？笰g85B排泄卵白的多克隆抗體本室制備。HRP標(biāo)識表記標(biāo)幟的羊抗鼠IgG及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購自北京中杉公司。G418、RPI1640造就液、TT

9、和淋巴細(xì)胞分散液,均購自北方同正公司。小牛血清購自GIB公司。SPF雌性57BL/6小鼠,68周齡,質(zhì)量1820g,購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)行動物中央。1.2要領(lǐng)2結(jié)果2.1Sp2/0細(xì)胞中Ag85BRNA及其卵白表達(dá)的檢測1瓊脂糖凝膠電泳闡發(fā):轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Sp2/0細(xì)胞的裂解液在880bp處出現(xiàn)一條顯著的帶,而未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Sp2/0細(xì)胞的裂解液那么無此條帶,表白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中有Ag85BRNA的表達(dá)(圖1)。2免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測:轉(zhuǎn)染的Sp2/0細(xì)胞經(jīng)G418挑選后,別離用抗Ag85B排泄卵白的多克隆抗體作為一抗和HRP標(biāo)識表記標(biāo)幟的羊抗鼠IgG作為二抗,結(jié)果表現(xiàn),Sp2/0細(xì)胞中有棕黃色的顆

10、粒,表白其可表達(dá)Ag85B排泄卵白圖2。圖1Sp2/0細(xì)胞中Ag85BRNA表達(dá)的檢測略Fig1AnalysisfAg85BRNAexpressininSp2/0ells1:NntransfetedSp2/0ells;2:Sp2/0ellstransfetedbypTB30;3:DNAarker.圖2Sp2/0細(xì)胞中Ag85B卵白表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測略Fig2DetetinfAg85BexpressininSp2/0ellsbyiunytheialstaining4002.3小鼠脾淋巴細(xì)胞殺傷活性的檢測TT比色法檢測表白,免疫后第30天、第60天,H37Ra免疫組和BG免疫組小鼠脾淋巴細(xì)

11、胞的殺傷率明顯高于PBS組(P005),H37Ra免疫組的殺傷率略優(yōu)于BG免疫組(P005,表1)。表1小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性殺傷率的檢測略Tab1DetetinfthespeifiyttxiityfiespleenlyphytesaP0.05vsPBSgrup;P0.05vsBGgrup.2.4脾淋巴細(xì)胞中穿孔素及顆粒酶BRNA的表達(dá)RTPR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn):H37Ra組和BG組小鼠脾淋巴細(xì)胞裂解液中穿孔素及顆粒酶BRNA的表達(dá)量均明顯高于PBS組P005。H37Ra組與BG組比擬力,穿孔素RNA的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P005;而顆粒酶BRNA的表達(dá)量,前者略多于后者但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖3、

12、圖4。圖3小鼠脾淋巴細(xì)胞中穿孔素RNA表達(dá)的檢測略Fig3DetetinftheperfrinRNAexpressininiespleenlyphytes:DNAarker;1:BGiunizatingrup;2:H37Raiunizatingrup;3:PBSntrlgrup.2.5脾淋巴細(xì)胞顆粒酶RNA的表達(dá)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞顆粒酶基因PR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖4A,基因表達(dá)的相對值見圖4B。結(jié)果表現(xiàn)H37Ra組和BG組顆粒酶RNA的表達(dá)量明顯高于PBS組P005,H37Ra組略高于BG組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。圖4小鼠脾淋巴細(xì)胞中顆粒酶BRNA表達(dá)的檢測略Fig4Detetinfthegranzy

13、eBRNAexpressininiespleenlyphytesA:AnalysisfgranzyeBRNAexpressinbyagarsegeleletrphresis.:DNAarker;1:H37Raiunizatingrup;2:BGiunizatingrup;3:PBSntrlgrup.B:TherelativedensityfgranzyeBRNAexpressin.3討論Ag85B是結(jié)核分枝桿菌的重要排泄卵白。本研究中以攜帶有Ag85B排泄卵白的真核表達(dá)質(zhì)粒pTB30轉(zhuǎn)染Sp2/0細(xì)胞后,用RTPR法檢測在Sp2/0細(xì)胞內(nèi)有Ag85BRNA的表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色表白,轉(zhuǎn)染重組

14、質(zhì)粒的Sp2/0細(xì)胞中有Ag85B卵白表達(dá)。接納TT法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性殺傷率,此法輕便易行,無需預(yù)標(biāo)靶細(xì)胞,與51r開釋法比力相干性好,還可測定淋巴細(xì)胞增殖活性和NK細(xì)胞活性。本實(shí)行表白,以結(jié)核桿菌H37Ra和BG免疫57BL/6小鼠后,均可產(chǎn)生Ag85B排泄卵白,從而便可誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性地殺傷Sp2/0靶細(xì)胞,且表現(xiàn)H37Ra組小鼠脾淋巴細(xì)胞的殺傷率略優(yōu)于BG組,提示結(jié)核桿菌H37Ra具有較好的免疫原性,免疫57BL/6小鼠后可誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。檢測脾淋巴細(xì)胞中穿孔素、顆粒酶BRNA表達(dá)的結(jié)果表白,穿孔素RNA的表達(dá)量明顯高于BG免疫組,與脾淋巴細(xì)胞殺傷活性的結(jié)果相符

15、合,其殺傷機(jī)制大概與細(xì)胞中穿孔素、顆粒酶BRNA表達(dá)增長有關(guān)。BG不克不及有用刺激D8+T細(xì)胞,從而導(dǎo)致個別產(chǎn)生的庇護(hù)力有限,外洋文獻(xiàn)報(bào)道7,8特異性D8+T細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷成效在抗結(jié)核分枝桿菌熏染中具有緊張的作用。本研究未分散D8+T細(xì)胞,但其結(jié)果為結(jié)核疫苗的研制提供了必然的實(shí)行根據(jù)。參考文獻(xiàn):1styS,usinsD,BrinkanJ,etal.GenideletinssuggestaphylgenyfrtheybateriutuberulsisplexJ.JInfetDis,2002,186(1):74-80.2DhianN,KhullerGK.Iunreativityfpeptide

16、sgeneratedbyliitedprtelysisf71kDaellallprtEinfybateriutuberulsisH37RausingPLGirpartilesJ.LettApplirbil,2000,30(5):345-350.3Sank,Satk,San,etal.parativeprfilesfintraarphagebehavirfybateriutuberulsisandybateriuaviuplexithdifferentlevelsfviruleneJ.irbilIunl,2002,46(7):483-486.4陶昆,盧賢瑜.H37Ra皮內(nèi)接種對巨噬細(xì)胞的激活效應(yīng)J.中國人獸共患疾病學(xué)報(bào),2022,22(3):232-235.5范雄林,徐志凱,白光春,等.結(jié)核桿菌Ag85B基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建J.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2000,16(4):314-315.6BalkS,KerstenA,TranTT,etal.nertedatinftheFasL/Fasandperfrin/granzyeAandBpathaysisandatryfrthedevelpentfearlyviralhepatitisbutntfrreveryfrviralinfetinJ.JVirl,2001,75(18):8781-8791.7anadayDH,ilk