淺析細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響因素及防控策略

1、摘要動物細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物科學(xué)中發(fā)展十分迅速的一種實驗技術(shù)。近年來，動 物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已從單純的實驗操作擴(kuò)展到生命科學(xué)、生物醫(yī)藥學(xué)等多個學(xué)科的 研究和生產(chǎn)領(lǐng)域，成為廣泛采用的技術(shù)手段，許多生物技術(shù)科學(xué)研究都離不開細(xì) 胞培養(yǎng)。本文從細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作方法入手，介紹了動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的主要 影響因素，以及對細(xì)胞實驗室無菌環(huán)境的防控策略。關(guān)鍵詞：細(xì)胞體外培養(yǎng)；影響因素；無菌環(huán)境；防控策略摘要 TOC o 1-5 h z 1弓|言1 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 2基礎(chǔ)理論概述1 HYPERLINK l bookmark13 o Current D

2、ocument 2.1細(xì)胞培養(yǎng)的概念1 HYPERLINK l bookmark16 o Current Document 2.2原代細(xì)胞培養(yǎng)的概念1 HYPERLINK l bookmark21 o Current Document 2.3傳代細(xì)胞培養(yǎng)2 HYPERLINK l bookmark26 o Current Document 3影響細(xì)胞體外培養(yǎng)的因素2 HYPERLINK l bookmark29 o Current Document 3.1細(xì)胞分離方法23.1.1直接分離法33.1.2酶消化法3 HYPERLINK l bookmark32 o Current Document

3、 3.2細(xì)胞培養(yǎng)溫度3 HYPERLINK l bookmark35 o Current Document 3.3細(xì)胞培養(yǎng)基的成分33.3.1天然培養(yǎng)基33.3.2合成培養(yǎng)基3 HYPERLINK l bookmark38 o Current Document 3.4接種密度.4 HYPERLINK l bookmark41 o Current Document 3.5培養(yǎng)基的pH值4 HYPERLINK l bookmark44 o Current Document 3.6細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇43.6.1細(xì)胞凍存.43.6.2細(xì)胞復(fù)蘇5 HYPERLINK l bookmark47 o Curr

4、ent Document 4細(xì)胞實驗室無菌環(huán)境的防控策略5 HYPERLINK l bookmark50 o Current Document 4.1無菌室的徹底消毒5 HYPERLINK l bookmark53 o Current Document 4.2培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌64.2.1 清洗.64.2.2消毒滅菌.6 HYPERLINK l bookmark60 o Current Document 4.3培養(yǎng)試劑的分裝與保存7 HYPERLINK l bookmark63 o Current Document 4.4對操作者的要求.7 HYPERLINK l bookmark66

5、o Current Document 5結(jié)語8 HYPERLINK l bookmark69 o Current Document 參考文獻(xiàn)9 HYPERLINK l bookmark77 o Current Document 致謝10淺析細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響因素及防控策略1引言細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)由于具有簡化細(xì)胞生長環(huán)境、明確生長條件、便于施加實 驗因素、容易獲得活體直接觀測實驗結(jié)果，以及方便控制培養(yǎng)產(chǎn)物等優(yōu)點，在醫(yī) 藥領(lǐng)域已成為研究發(fā)病機(jī)理和篩選藥物的重要手段，在分子生物學(xué)領(lǐng)域，利用細(xì) 胞培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)合細(xì)胞融合、細(xì)胞雜交以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)，進(jìn)行基因重組、組織構(gòu) 建，成為分子遺傳和組織工程研究者的重要

6、研究工具，利用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重 要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部 分。近年來，分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)獲得巨大進(jìn)展，培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)被廣泛應(yīng)用 于該領(lǐng)域的研究，這些培養(yǎng)的細(xì)胞已成為基因工程、遺傳工程、體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn) 基因動物、生物制藥、干細(xì)胞、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、免疫 學(xué)等學(xué)科研究的有力工具和重要途徑。2基礎(chǔ)理論概述2.1細(xì)胞培養(yǎng)的概念細(xì)胞培養(yǎng)是指將細(xì)胞從機(jī)體中取出，人工模擬機(jī)體內(nèi)生理條件，在無菌、 適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使其生存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、 細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等的研究工作，是維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的體外培養(yǎng)方法。2

7、.2原代細(xì)胞培養(yǎng)的概念原代培養(yǎng)是指取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前 稱為原代培養(yǎng)，這是細(xì)胞培養(yǎng)的最初和必經(jīng)階段。培養(yǎng)方法包括：單層細(xì)胞培養(yǎng) 和懸浮培養(yǎng)。單層細(xì)胞培養(yǎng)：將取下的組織塊無菌剪切后，用0.25%胰酶消化，使細(xì)胞 分離，再用無菌Hanks液或0.85%NaCl溶液洗滌后，置培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞多取材于血液或體腔液，一般采用離心法分 離細(xì)胞，低速500-1000r/min,離心5-10min即可。培養(yǎng)時，只要取適當(dāng)濃度的 細(xì)胞懸液接種于完全培養(yǎng)液中，細(xì)胞就能增殖。2.3傳代細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)是指細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新

8、的培 養(yǎng)器皿中，即當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞生長到一定時期，受到群體環(huán)境限制，就需要轉(zhuǎn)移 到另一容器才能繼續(xù)生長，稱為傳代或繼代培養(yǎng)。根據(jù)原代培養(yǎng)物性狀的一致性 與否，傳代成功后稱為細(xì)胞系或細(xì)胞株。這些細(xì)胞一般可順利傳40-50代次，并 保持染色體二倍體數(shù)量和接觸抑制，傳至50代左右時則出現(xiàn)生長停滯，大部分 衰老死亡，此類稱為有限細(xì)胞系/株。一般細(xì)胞原代培養(yǎng)1-4周后，需要進(jìn)行分 離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會因生存空間不足或由于細(xì)胞密度過大引起營養(yǎng)枯竭，影響細(xì) 胞的生長繁殖。在細(xì)胞傳代的過程中，有些因發(fā)生遺傳突變獲得了持久性增殖能力的細(xì)胞稱 為無限細(xì)胞系/株。傳代次數(shù)與物種壽命有關(guān)：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽

9、命200年，傳代140次。人傳代次數(shù)與個體年齡成反比：人胚胎40-60代；幼年 20-40代；成年10-30代；得了早老病的兒童2-10代。傳代培養(yǎng)的方式主要有： 貼壁型細(xì)胞傳代和懸浮型細(xì)胞傳代。貼壁型細(xì)胞傳代：傳代時需要用胰酶將細(xì)胞消化，使其從支持物上脫落， 或用EDTA溶液與胰酶按體積比為1:1或1:2比例混合后聯(lián)合使用。過濾除菌 后小量分裝，于-20C保存。消化時吸去培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入適量的EDT A溶液與胰酶的混合液，以能覆蓋細(xì)胞層為宜，將培養(yǎng)瓶平放，37C作用3-5min， 加入Hanks液，1000r/min離心5min即可除去消化液，洗1-2次后加入完全培養(yǎng) 液，計數(shù)，置培養(yǎng)

10、皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。懸浮型細(xì)胞傳代：傳代時用吸管將細(xì)胞吹打均勻，特別是一些成團(tuán)生長 的細(xì)胞，應(yīng)將細(xì)胞團(tuán)塊打散。根據(jù)細(xì)胞生長狀況的不同，用吸管將細(xì)胞懸液吸去 適當(dāng)?shù)牧?，然后再加入完全培養(yǎng)液至原體積3影響細(xì)胞體外培養(yǎng)的因素3.1細(xì)胞分離方法細(xì)胞分離方法細(xì)胞培養(yǎng)之前，首先要進(jìn)行組織塊的分離，其主要方法包括： 直接分離法（包括機(jī)械法和EDTA螯合法）和酶消化法（包括胰蛋白酶消化和膠 原酶消化）。3.1.1直接分離法該方法分離得到的細(xì)胞數(shù)量沒有酶消化法得到的多，但可滿足一般實驗的要 求，該方法的優(yōu)點是操作流程簡單，不需要復(fù)雜的儀器和昂貴的膠原酶。3.1.2酶消化法多用于新生動物組織或動物胚胎的肝細(xì)胞培養(yǎng)。

11、胰蛋白酶消化法具有分離效 果好、操作簡單和價格便宜的特點，因為胰酶消化的條件很難掌握，所以未被廣 泛應(yīng)用；膠原酶消化法具有分離效果好、細(xì)胞產(chǎn)量高（即時存活率高、對細(xì)胞損 傷?。⒕S持細(xì)胞特異性功能的時間長等優(yōu)點。3.2細(xì)胞培養(yǎng)溫度不同種類的動物細(xì)胞對溫度的要求并不一致，如人和哺乳動物的細(xì)胞培養(yǎng)溫 度為35-37C，鳥類細(xì)胞培養(yǎng)溫度為38.5C，鼠類細(xì)胞為34C。一般來說，細(xì)胞 對低溫的耐受力比高溫強(qiáng)。因此，在細(xì)胞的培養(yǎng)過程中要及時地根據(jù)細(xì)胞的類型 調(diào)整適宜的溫度。在使用恒溫培養(yǎng)箱時，箱內(nèi)溫度應(yīng)維持在37C、CO2體積分 數(shù)為5%。3.3細(xì)胞培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞

12、生殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng) 細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多，按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng) 基和液體培養(yǎng)基，按其來源分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。3.3.1天然培養(yǎng)基最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細(xì) 胞生長因子、促貼附因子及多種活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞順利增 殖生長。質(zhì)量好的血清應(yīng)該是無溶血、橘黃色清亮透明、無細(xì)菌、無支原體污染 的黏稠狀液體。血清的體積分?jǐn)?shù)要控制在5%-20%，當(dāng)超過30%時反而不利于細(xì) 胞生長，過高或過低的血清體積分?jǐn)?shù)都不利于細(xì)胞的生長和增殖。一般將血清保 存于-20C以下，時間不易過長。3.3.2合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)

13、細(xì)胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴(yán)格配制而成的。內(nèi)含碳水化 合物、氨基酸、脂類、無機(jī)鹽、維生素、微量元素和細(xì)胞生長因子等。單獨使用 細(xì)胞雖有生存但不能很好地生長增殖。迄今為止，人工合成的培養(yǎng)基已有多種， 如RPMI-1640、Eagles MEM、DMEM等，其主要差別在于氨基酸、維生素、無 機(jī)鹽和能源物質(zhì)的組成及含量不同。一般認(rèn)為RPMI-1640營養(yǎng)全面，對各種組 織生長都適用；Eagles MEM適合于細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)；DMEM有利于細(xì)胞的 分裂增殖；Hams F12能促進(jìn)細(xì)胞的分化。也有學(xué)者將不同培養(yǎng)基混合應(yīng)用，從 而得到較好的培養(yǎng)效果。培養(yǎng)液中的抗生素是青霉素和鏈霉素。此外，卡那霉素、 新霉

14、素、兩性霉素、氯霉素等都可以防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)菌和真菌的感染。3.4接種密度一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長，細(xì)胞密度過大時，養(yǎng)分不 足，使細(xì)胞迅速老化；而密度過小時，不利于細(xì)胞單層的形成。在傳代培養(yǎng)中， 細(xì)胞的密度取決于傳代的時間。一般分瓶的稀釋比例為1:3至1:6，依細(xì)胞種類 而異。在細(xì)胞生長的外部條件完全相同的情況下，細(xì)胞分散比率不同會導(dǎo)致不同 的增殖倍數(shù)，影響細(xì)胞產(chǎn)量，這對培養(yǎng)種細(xì)胞尤其重要。3.5培養(yǎng)基的pH值在培養(yǎng)動物細(xì)胞時，不同種動物或是同一種動物的不同部位對pH值的要求 各不相同。一般認(rèn)為，動物細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值一般在7.2-7.4，呈弱堿性。培養(yǎng) 過程中pH值低于

15、6.8時對細(xì)胞生長會有抑制作用，細(xì)胞生長緩慢；而當(dāng)pH高 于7.6時則細(xì)胞不能生長，這可能是由于空氣的接觸而導(dǎo)致培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分 被氧化所致。3.6細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的基本原則是“慢凍快融”，實驗證明這樣可以最大限度地 保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)都 能提高細(xì)胞膜對水的通透性。緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞 內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融 化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化 使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。3.6.1細(xì)胞凍存?zhèn)鞔囵B(yǎng)的細(xì)胞

16、，如果暫時不用，可以冷凍保存。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于 -196C液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起 來，在需要的時候再復(fù)蘇細(xì)胞后用于實驗。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以 防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的 作用。除此之外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細(xì) 胞。細(xì)胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑至終體積分?jǐn)?shù)5%。15%的甘油或二甲基 亞砜（DMSO），可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下細(xì)胞內(nèi)水分透出， 減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1C/min或者-2C /min，當(dāng)溫度低于-25 C

17、時可加速，到-80C之后可直接投入液氮內(nèi)（-196C）。3.6.2細(xì)胞復(fù)蘇復(fù)蘇細(xì)胞的原則為快速解凍，從液氮中取出細(xì)胞凍存管之前應(yīng)準(zhǔn)備好38C 的溫水，凍存管取出后用鑷子夾住頂端迅速放入溫水中，結(jié)束后還要在75%酒 精中清洗幾次，除去透明過程中染上的雜質(zhì)。為縮短透明時間，可將標(biāo)本放在烘 十箱或燈光下加熱，透明時間長短根據(jù)標(biāo)本大小、多少和環(huán)境溫度而定。凍存復(fù) 蘇后的狀態(tài)主要與凍存保護(hù)劑的種類、濃度以及細(xì)胞復(fù)蘇方法和復(fù)蘇后培養(yǎng)液中 小牛血清濃度等有關(guān)。二甲基亞砜（DMSO）是一種具有非常強(qiáng)的溶解能力和非 凡滲透能力的化學(xué)物質(zhì)，也是應(yīng)用最廣泛的體外培養(yǎng)細(xì)胞凍存保護(hù)劑，其常用體 積分?jǐn)?shù)為10%20%，不

18、同種屬細(xì)胞的最適濃度也存在一定差別。4細(xì)胞實驗室無菌環(huán)境的防控策略目前細(xì)胞培養(yǎng)過程中最主要的問題就是污染，污染可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而造 成人力、財力和時間的損失，有時還可能造成特殊材料的不可再用。因此，在做 細(xì)胞實驗時，一定要盡力避免污染的發(fā)生。4.1無菌室的徹底消毒無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。一般情況下， 無菌室每周都要徹底清潔、消毒1次，用稀釋的新潔爾全面徹底地擦洗無菌室的 臺面和地板，用屋頂裝置的紫外燈照射整個細(xì)胞培養(yǎng)室30-60min，以對環(huán)境進(jìn) 行消毒。實際工作中，要根據(jù)無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。在 超凈工作臺區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，如

19、試管架、吸管盒等可暫時放置， 其他實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流的通暢。超凈臺的平均風(fēng)速保持在 03.2-0.48m/s為宜，過大、過小均不利于保持凈化度。使用前最好開啟超凈臺內(nèi) 紫外燈照射10-30min，然后讓超凈臺預(yù)工作10-15min，以除去臭氧和使工作臺 面空間呈凈化狀態(tài)。使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈， 以保證超凈臺無菌。4.2培養(yǎng)用品的清洗和消毒滅菌細(xì)胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、 布類、紙類等，從事細(xì)胞培養(yǎng)的工作人員必須要掌握這些物品的清洗和消毒滅菌 的知識與方法。4.2.1清洗離體條件下，細(xì)胞對任何有害物質(zhì)十分敏感，極少

20、殘留物都可以對細(xì)胞產(chǎn)生 毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認(rèn)真清洗，達(dá)到不含任何殘留物 的要求。玻璃器皿的清洗：一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗4個步驟。橡膠制品清洗：新的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/L NaOH煮沸15min，流 水沖洗；0.5mol/L HCl煮沸15min，流水沖洗；自來水煮沸2次;蒸餾水煮沸20min； 50C烤干備用。塑料制品的清洗：塑料制品由于質(zhì)軟而易出現(xiàn)劃痕，耐腐蝕能力強(qiáng)但不 耐熱。使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，然后用紗布(或棉簽)和 50C清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15min，流水沖洗(15-20遍)， 蒸餾水浸洗3次，雙蒸水

21、泡24h，晾干備用。包裝：對細(xì)胞培養(yǎng)用品進(jìn)行消毒前，要進(jìn)行嚴(yán)密包裝，以便于消毒和貯 存。常用的包裝材料有牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿等，近幾年 用鋁箔包裝非常方便、適用。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝 入飯盒內(nèi)，較大的器皿可以進(jìn)行局部包扎。4.2.2消毒滅菌微生物污染是造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因，對于已經(jīng)清洗的器皿要進(jìn)行滅 菌處理，常用的方法是高溫濕熱滅菌和高溫干熱消毒兩種方法。(1)高溫濕熱滅菌。此法是最常用的滅菌方法，對生物材料有良好的穿透力， 能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、玻璃器皿、金屬器皿、膠和 某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。不同壓力蒸氣的溫度

22、不同，不同消毒物品所需 的有效消毒壓力和時間不同。從壓力蒸氣消毒器中取出消毒好的物品（不包括液 體），應(yīng)立即放到60-70C烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面 容易為微生物污染。（2）高溫干熱滅菌。此法主要是將物品放入電熱烤箱內(nèi)加熱到160C以上，并 保持90-120min，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如 體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）、金屬器皿以及不能與蒸氣接觸的物品（如粉劑、油 劑）。干熱滅菌后要關(guān)掉開關(guān)并使物品逐漸冷卻后再打開，切忌立即打開，以免 溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。電熱箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加 熱裝置。4.3培養(yǎng)試劑的分裝與保存培養(yǎng)

23、液和胰酶的配制用水是三蒸水或符合培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的水。試劑的除菌方 法采用過濾除菌法，最好使用一次性的濾器和濾膜，如果是反復(fù)使用的濾器則應(yīng) 在過濾前先將濾器和濾膜高壓滅菌，而后在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行過濾分裝，接收濾 液的容器也需事先高壓滅菌。配制好的培養(yǎng)液經(jīng)測試確認(rèn)沒有污染方可用于培養(yǎng) 細(xì)胞。配好的試劑于4C保存。培養(yǎng)細(xì)胞所用的血清必須儲存于-20-70C，但不 能超過1個月，解凍時在-20C或-70-4C冰箱溶解1天，至室溫下全溶后再分裝， 在溶解過程中要規(guī)則搖晃均勻，使溫度與成分均一，這樣可以減少沉淀。最好不 要直接在37C解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。4.4對操作者的要求有

24、很多污染的發(fā)生都與實驗操作人員操作不當(dāng)有關(guān)，細(xì)胞培養(yǎng)實驗的操作應(yīng) 是嚴(yán)格的無菌操作。首先實驗進(jìn)行前，無菌操作臺面、手術(shù)器械、廢液缸及實驗 用品均應(yīng)用紫外燈照射30-60min滅菌；以70%酒精擦拭無菌操作臺面，并開啟 無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10min后，方可開始實驗操作。實驗操作人員進(jìn)培養(yǎng)間之前，須先洗手，在緩沖間換穿專用實驗服和拖鞋， 準(zhǔn)備好與細(xì)胞培養(yǎng)操作實驗有關(guān)的所有試劑和用品，嚴(yán)禁在實驗進(jìn)行時頻繁出入 培養(yǎng)間。在無菌操作臺開始操作前須戴一次性乳膠手套，并用70%酒精擦拭、 擦瓶口和燒灼瓶口。在實驗過程中，要求實驗人員規(guī)范操作，嚴(yán)格遵守?zé)o菌工作流程。操作者動 作要輕，安裝吸管帽、打開或封閉瓶口

25、等操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。操 作時盡量不要談話、咳嗽，以防止來自唾沫和呼出的氣流所造成的污染。使用培 養(yǎng)液前不宜過早開瓶，開瓶后的培養(yǎng)液應(yīng)保持斜位，避免直立，以防止下落細(xì)菌 的污染。不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封閉瓶口，培養(yǎng)的細(xì)胞在處理之前勿過早暴露 在空氣中。吸取培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液時，應(yīng)專管專用，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和 其他污染物品應(yīng)棄去，以防止污染擴(kuò)大或造成培養(yǎng)物之間的交叉污染。做完實驗 后應(yīng)將實驗產(chǎn)生的廢物和廢液及時移出培養(yǎng)間，并用消毒水浸泡的紗布擦拭臺 面，保證工作臺清潔無菌。5結(jié)語動物細(xì)胞培養(yǎng)作為現(xiàn)代多個學(xué)科領(lǐng)域研究的重要技術(shù)，具有越來越占有重要 的地位。目前，動物細(xì)胞培養(yǎng)已在理論基礎(chǔ)、技術(shù)優(yōu)