人3型腺病毒重組六鄰體蛋白的純化及免疫學研究(研究生)

1、人3型腺病毒重組六鄰體蛋白的純化及免疫學研究Q260046902 專業(yè)做論文- PAGE 42 -PAGE 43 哈爾濱醫(yī)科大學碩士學位論文目 錄中文摘要要 2英文摘要要 3文獻綜述述 4前言 13實驗材料料 15實驗方法法 21實驗結果果 27討論 32結論 35參考文獻獻 36致謝 41個人簡歷歷 42中文摘要要目的 腺腺病毒(Adeenovviruus,AAdV)是引起起人類呼呼吸道和和消化道道感染的的重要病病原之一一，嚴重重威脅著著人類的的健康。腺病毒毒導致小小兒肺炎炎，尤其其是6個月至至2歲的嬰嬰幼兒腺腺病毒肺肺炎最為為嚴重，感染主主要是以以3, 5, 7型為為主,所所以建立立有效的

2、的防治腺腺病毒感感染措施施意義重重大。六六鄰體是是腺病毒毒主要的的結構蛋蛋白，能能夠刺激激機體產產生相應應的抗體體，抑制制病毒體體構象的的改變，從而中中和病毒毒體。本本實驗組組已經成成功克隆隆并表達達了重組組人3型型腺病毒毒六鄰體體L1、L2亞亞基，本本次實驗驗旨在純純化重組組六鄰體體亞基蛋蛋白，檢檢測其抗抗原性、特異性性及體外外保護情情況。方方法在原原核表達達系統(tǒng)EE.cooli M155中高效效表達重重組人33型腺病病毒六鄰鄰體蛋白白。利用用Ni-NTAA瓊脂糖糖親和層層析柱進進行蛋白白純化。用純化化的重組組六鄰體體蛋白免免疫新西西蘭家兔兔,利用用免疫印印跡技術術檢測其其血清中中抗體，鑒定

3、該該蛋白的的免疫原原性和反反應原性性。利用用固定病病毒-稀稀釋血清清方法進進行中和和實驗，計算其其中和抗抗體效價價。結果果得到到純化的的重組人人3型腺腺病毒六六鄰體蛋蛋白，該該蛋白免免疫動物物后產生生高效價價抗體,達到11：100240000，該抗體體能與人人3型腺腺病毒、含有該該蛋白的的重組工工程菌株株以及重重組六鄰鄰體蛋白白發(fā)生特特異性的的免疫印印跡反應應(Weesteern bloot)，不與EE.cooli M155菌株、BSAA蛋白、柯薩奇奇病毒和和Hella細胞胞等反應應，證明明該重組組六鄰體體蛋白具具有良好好的免疫疫原性和和反應原原性以及及3型腺腺病毒特特異性。在中和和實驗中中，

4、該抗抗體可以以有效地地中和人人型腺腺病毒的的感染，中和效效價為11:8000，結結論所所獲得的的重組人人3型腺腺病毒六六鄰體蛋蛋白具有有良好的的抗原性性和特異異性,其產生生的抗體體具有良良好的保保護作用用，為開開發(fā)研制制高效、無毒的的腺病毒毒基因工工程疫苗苗奠定基基礎。 關鍵鍵詞 六鄰體體；純化化；免疫疫保護；中和抗抗體Puriificcatiion andd sttudyy onn thhe iimmuunollogyy off reecommbinnantt heexonn off huumann tyype-3 aadennoviirussAbsttracctObjeect: Thhe

5、aadennoviiruss onne oof tthe maiin ppathhogeeny whiich cauuse resspirratoory traact andd allimeentaary inffecttionn annd ccausse mmoree annd mmoree seerioous. Addenoovirrus cann caauseechiild pneeumooniaa annd tthe majjor inffectted typpes aree tyype 3, 5 aand 7 eet aal，sso tto eestaabliish an efffe

6、cttiveesteep tto pprevventtionn annd ccureeAdeenovviruus iinfeectiion hass a siggnifficaant meaaninng. Hexxon is thee maajorr sttruccturre pprotteinn off addenoovirrus. Itt sttimuulattes thee boody to prooducce aantii-boody andd innhibbitss coonsttrucct sshifft oof vviruus tto nneuttrallizee thhe vv

7、iruus bbodyy ittsellf.wwe hhavee allreaady cloonedd annd eexprresssed thee reecommbinnantt heexonn off huumann tyype-3 aadennoviiruss.Noow wwe iinteend to purrifyy thhe rrecoombiinannt hhexoon oof hhumaan ttypee-3 adeenovviruus aand dettectt itts aantiigenniciity、speecifficiity andd coonseervaatioon

8、 eex vvitrro. Methhodss： UUndeer tthe opttimuum exppresssioon ccondditiionss, tthe hexxon prooteiin oof hhumaan ttypee 3 adeenovviruus wwas effficiienttly exppresssedd inn E Colli. Thee exxpreesseed pprotteinns wweree puuriffiedd byy meeanss off Nii-NTTA aaffiinitty cchroomattogrraphhy. Usiing thee

9、puuriffiedd heexonn too immmunne rrabbbit andd teest thee heexonns anttigeeniccityy wiith thee meethood oof WWestternn-bllot tecchniiquee. tto ttestt nneuttrallizaatioon aantiiboddy bby mmeanns oof ffixeed vviruus-ddiluutedd seerummwaay.RResuultss： TThe hexxon of humman typpe 33 addenoovirrus wass p

10、uuriffiedd annd wwas proovedd too immmunne tthe rabbbitt wiith higgh aantiiboddy ttiteer (1:1102440000)annd tthe anttiboody reaacteed sspeccifiic wwithh thhe ppuriifieed rrecoombiinannt hhexoon,nnot reaacteed wwithh E.colli、BBSA、Coxxsacckiee viiruss annd HHelaa ceell , tthe reccombbinaant E.ccolii s

11、ttraiin cconttainningg thhe hhexoon pprotteinn annd tthe typpe 33 addenoovirrus itsselff. TThuss itt waas pprovved thaat tthe reccombbinaant prooteiin pposssesssed botth oof tthe higgh aantiigenniciity andd hiigh speecifficiity to typpe 33 addenoovirrus.In NA tesst , thhe aantiiboddy ccan neuutraali

12、zze aadennoviiruss efffecctivvelyy annd iits neuutraalizzatiion anttiboody titter is 1：8000 .CConcclussionns： Thhe rrecoombiinannt hhexoon hhas higgh iimmuunoggeniicitty aand reaactiionoogenniciity andd sppeciificcityy.Itts aantiiboddy hhas remmarkkablle pprottecttionn.Thiis iis vveryy immporrtannt

13、tto pprodducee efficiientt annd nnonttoxiic ggeneeticc ennginneerringg vaacciineaagaiinstt addenoovimms iinfeectiionKey worrds： heexonn, pprotteinn puurifficaatioon, immmunoogenniciity,neuutraalizzatiion anttiboody文獻綜述述腺病毒(Adeenovviruus,AAdV)是引起起人類呼呼吸道和和消化道道感染的的重要病病原之一一，嚴重重威脅著著人類的的健康1。在55歲兒童童的急性性呼吸系

14、系統(tǒng)疾病病中，腺腺病毒引引起的肺肺炎較為為嚴重；在3歲歲以下兒兒童還易易引起急急性肺炎炎，以33，5，7型為為主22。近些年在在北方地地區(qū)曾有有過腺病病毒的暴暴發(fā)流行行，嚴重重地威脅脅著兒童童的健康康和生命命安全，因此，對腺病病毒進行行快速、特異性性診斷和和預防具具有重大大意義。腺病毒毒六鄰體體是腺病病毒的主主要抗原原，刺激激機體產產生抗體體，抑制制病毒體體構象的的改變，從而中中和病毒毒體33。本本文綜述述了近些些年來腺腺病毒的的國內外外研究現(xiàn)現(xiàn)狀，對對其致病病性、一一般特征征、免疫疫學特性性、疫苗苗及應用用進行探探討。一.腺病病毒(AAdennoviiruss,AddV)是是引起人人呼吸道道

15、和消化化道感染染的重要要病原之之一。腺病毒肺肺炎是由由腺病毒毒感染肺肺部引起起的肺炎炎,是病毒毒性肺炎炎中最嚴嚴重的一一種。它它是由33 型和和7 型腺腺病毒所所引起的的,主要是是由腺病病毒造成成的氣管管、支氣氣管上皮皮廣泛壞壞死,引起支支氣管管管腔閉塞塞,致使病病情加重重,最終導導致肺功功能損害害和其他他功能障障礙。不不少危重重患兒雖雖然經過過搶救挽挽回了生生命,但由于于肺組織織破壞較較重,遺留不不同程度度的慢性性肺部疾疾病,如支氣氣管擴張張癥等,對兒童童的健康康危害極極大4 。腸腺病毒毒(ennterric adeenovviruus)是是嬰幼兒兒腹瀉的的重要病病原體。屬于普普通腺病病毒的

16、440 ,41 血清型型,外形與與普通腺腺病毒相相同,為直徑徑7080nnm 的的雙鏈DDNA 病毒,主要侵侵犯嬰幼幼兒,通過人人與人的的接觸傳傳播,也可經經糞口途徑徑及呼吸吸道傳播播5 。本本病無明明顯季節(jié)節(jié)性,夏秋季季略多,可呈暴暴發(fā)流行行。臨床床表現(xiàn)為為較重的的腹瀉,稀水樣樣便,每日330 次。常常有呼吸吸道癥狀狀。如咽咽炎、鼻鼻炎、咳咳嗽等,發(fā)熱及及嘔吐較較輕,可有不不同程度度的脫水水征。病病程812 d。多多數(shù)患兒兒病后557 個月月內對蔗蔗糖不耐耐受,并可伴伴有吸收收不良。二、 腺腺病毒的的分類及及其一般般特征腺病毒在在自然界界分布十十分廣泛泛，存在在于各種種動物體體內, 分為感感

17、染鳥類類(Avviaddenoovirrus)和哺乳乳動物(Masstaddenoovirrus)的兩個個屬。后后者從99種不同同的宿主主中共分分離到1101種種,其中中研究最最廣泛的的是人腺腺病毒。目前,人類腺腺病毒共共發(fā)現(xiàn)551種血血清型6（以英文文字母和和數(shù)字表表示）,可分為為AFF六個亞亞屬。它它們在組組織趨向向性等方方面都有有著不同同的特性性7。AE各組組型病毒毒能在人人的組織織細胞（腎細胞胞）常規(guī)規(guī)培養(yǎng)中中增殖, 稱為為普通腺腺病毒,F組的的40、41型型病毒是是從糞便便中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)用常規(guī)規(guī)細胞培培養(yǎng)不能能增殖的的腺病毒毒,稱為為腸道腺腺病毒。有些腺腺病毒在在動物體體內可致致瘤，在在體

18、外能能轉化細細胞88。 腺病病毒無包包膜，220面體體對稱，直徑為為7090nnm，有有2522殼粒，其中220面頂頂角殼粒粒為122個五鄰鄰體（ppentton，82KKD），每個五五鄰體有有2條纖纖維，長長度相同同或不同同纖維上上帶有主主要的種種特異性性抗原決決定簇和和次要的的亞屬特特異性抗抗原決定定簇。除除五鄰體體外有2240個個非頂角角殼粒，稱為六六鄰體（Hexxon,1200KD），后者者帶有主主要的屬屬和亞屬屬特異性性抗原決決定簇和和次要的的種特異異性抗原原決定簇簇9（圖一一）。圖一、腺腺病毒的的結構Fig 1. Strructturee off addenoovirrus腺病毒的

19、的形態(tài)是是特征性性的二十十面體病病毒殼體體（Sttewaart et al., 119933）。其其病毒殼殼體含有有三種主主要的蛋蛋白：六六鄰體（II），五鄰鄰體基底底（IIII）和和纖突（IV），還有有多種其其他的輔輔助蛋白白VI，VIIII，IIX，IIIIaa和Ivva2（Figg. 11）。腺腺病毒基基因組是是一個線線性的雙雙鏈DNNA，其其5端端與一種種末端蛋蛋白（TTP）共共價結合合，5端上還還具有末末端反向向重復序序列（IITRss）。病病毒DNNA與核核心蛋白白VIII和一個個稱為mmu的小小肽緊密密結合。另一種種蛋白VV包被在在DNAA-蛋白白復合物物上，并并且通過過蛋白VV

20、I為DDNA-蛋白復復合物和和病毒殼殼體間提提供了結結構上的的聯(lián)系10。病毒毒含有一一種病毒毒自身編編碼的蛋蛋白酶，這種蛋蛋白酶對對于加工工某些結結構蛋白白從而產產生成熟熟的具有有感染性性的病毒毒是必需需的111。腺腺病毒家家族（AAdennoviiriddae）的成員員可感染染種類相相當廣泛泛的有絲絲分裂后后細胞，甚至包包括來自自高度分分化的組組織中的的細胞，例如骨骨骼肌細細胞，肺肺細胞，腦細胞胞和心臟臟細胞。因為腺腺病毒可可將自身身的基因因組遞送送到細胞胞核中，并且高高效率地地復制，所以腺腺病毒成成為表達達和傳遞遞治療基基因的主主要候選選者112，113。三、六鄰鄰體蛋白白的結構構和功能能

21、目前,已已對六鄰鄰體蛋白白（圖二二）進行行了廣泛泛的結構構和功能能的研究究144。每每個六鄰鄰體是六六鄰體蛋蛋白的同同源三聚聚體，是是大于9900個個殘基的的復雜蛋蛋白115。三聚體體的六鄰鄰體分子子有一個個五面體體的基底底和三角角形的塔塔尖，基基底包含含兩個區(qū)區(qū)域P11、P22區(qū)，經經過對AAd2電電子顯微微鏡觀察察和x線線衍射分分析，PP1、PP2在內內部卷曲曲成8個個穩(wěn)定的的折疊反反向平行行結構,塔區(qū)由由三個環(huán)環(huán)構成LLoopp1、LLoopp2、和和Looop4。通過用用一組單單克隆抗抗體來檢檢測不同同型的純純化的六六鄰體蛋蛋白表明明，在六六鄰體表表面有許許多的抗抗原決定定簇存在在在這

22、幾幾個環(huán)上上。對LLoopp1、Looop22、Looop4進進行了研研究，其其中Looop22、Looop4卷卷曲成團團，和三三聚體中中的其它它兩個多多肽鏈的的相應區(qū)區(qū)域相互互作用,環(huán)間相相互指狀狀突起使使得三聚聚體的結結構相當當穩(wěn)定16。Looop1是是最長、最復雜雜的環(huán)，自身折折疊許多多倍，向向外突起起最大限限度的與與周圍環(huán)環(huán)境相互互作用。對155個不同同型的腺腺病毒的的六鄰體體蛋白的的核酸序序列研究究表明基基底的PP1、PP2區(qū)是是保守的的，變化化區(qū)主要要集中在在Looop1、Looop2區(qū)區(qū)177。Looop1、Looop2的的所對應應的氨基基酸是11419914228個氨氨基酸，其

23、中有有2500個變化化的殘基基，存在在有七個個獨特的的超變區(qū)區(qū)（HVVR），在這七七個HVVRS中中，HVVR1HVRR6出現(xiàn)現(xiàn)在Looop11中，HHVR77在Looop22的塔尖尖。這些些HVRRS在不不同的血血清型之之間的長長度有所所不同，變化范范圍在22388個氨基基酸之間間。其中中HVRR1、HHVR22、HVVR4、HVRR5、HHVR77中含有有中和抗抗原決定定簇的一一部分18，而且且抗原決決定簇的的至少包包括兩個個或兩個個以上的的HVRRS。在在這五個個HVRRS中包包括大于于99%的六鄰鄰體型特特異性殘殘基。在在Looop1、Looop2當當中，這這些保守守性殘基基形成HHV

24、R區(qū)區(qū)的框架架，代表表著臨近近區(qū)域的的不連續(xù)續(xù)鏈的相相互作用用，2/3的保保守序列列是疏水水性的更更說明它它們承擔擔的是結結構功能能。在HHVRSS區(qū)中，HVRR1、HHVR66是Looop11內部支支持區(qū)，而且HHVR11是殘基基變化最最多的區(qū)區(qū)域。HHVR44、HVVR5是是Looop1的的主要外外部支持持區(qū)，HHVR55位于塔塔尖，塔塔區(qū)的重重量變化化主要由由這兩個個區(qū)域來來決定。目前，這五個個HVRRS區(qū)相相應的氨氨基酸序序列以及及所對應應的核苷苷酸序列列已經確確定。由由于這五五個HVVRS位位于Looop11、Looop2, 所以以Looop1、Looop2是是較好的的中和抗抗原決定

25、定簇119。圖二、六六鄰體蛋蛋白的結結構Fig 2.SStruuctuure of hexxon六鄰體是是病毒的的主要抗抗原蛋白白,含有有大量的的抗原表表位,如如型、型型間及組組特異性性抗原表表位及中中和性表表位。但但大部分分抗原表表位在蛋蛋白的一一級結構構上還沒沒有被確確切定位位200。不不同型別別的六鄰鄰體有很很高的保保守(778%95%)221，型間與與組特異異性抗原原表位定定位于這這些保守守的區(qū)域域，可能能具有一一定的抗抗原性，可作為為病毒感感染性疾疾病診斷斷的靶抗抗原位點點。在六鄰體體的前段段和中段段,有大大量的抗抗原性高高峰及較較密的親親水性高高峰區(qū)域域。該區(qū)區(qū)域含有有大量的的保守

26、區(qū)區(qū)，可能能具有較較強的抗抗原性及及很好的的暴露性性，并期期望能夠夠作為型型間特異異性表位位，誘導導高效價價的抗HHAdVV特異性性抗體。六鄰體體的后段段主要由由環(huán)4、P2區(qū)區(qū)組成，盡管該該區(qū)域在在病毒顆顆粒上亦亦有較好好的抗原原暴露性性，并且且序列的的同源性性較高，但疏水水性氨基基酸殘基基較多。抗原性性預測分分析顯示示，六鄰鄰體后段段的抗原原性高峰峰較稀少少，相反反，疏水水性高峰峰多而密密，提示示該區(qū)域域的總體體抗原性性較弱。四、腺病病毒血清清型的確確定腺病毒血血清型的的確定是是根據(jù)感感染性中中和反應應，它是是型特異異性，直直接針對對六鄰體體蛋白的的中和抗抗原決定定簇。血血清型又又根據(jù)核核苷

27、酸的的同源性性、纖維維蛋白的的特性以以及生物物學特性性來區(qū)分分為六個個亞型（A、BB、C、D、EE、F）另據(jù)研研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)，在這這幾個中中和抗原原決定簇簇所在的的幾個超超變區(qū)HHVR11、HVVR2、HVRR4、HHVR55、HVVR7當當中，發(fā)發(fā)生了廣廣泛的染染色體的的非正常常重組22，包括括短的直直接重復復序列的的缺失、插入、重疊。而且AAdv血清清型的進進化是由由于在HHVRSS中發(fā)生生非正常常的重組組（抗原原行遷移移），并并伴隨有有單一堿堿基的突突變。，而且六六鄰體蛋蛋白的血血清特異異型也位位于Looop11、Looop22的七個個HVRRS中。在在HVRRS的重組組又形成成獨特的的新的

28、血血清型，這種獨獨特的血血清型由由組成中中和抗原原決定簇簇的殘基基的數(shù)目目、位置置、生物物學特性性所決定定。此處處需要指指出的是是血清型型的鑒定定不局限限于中和和反應，有研究究者利用用限制性性酶切分分析，鑒鑒定特異異性區(qū)域域(SSSR)來來確定血血清型，而且所所需的時時間比中中和反應應所需的的時間少少的多，前者只只需一周周，后者者要三周周，最后后二者的的結果完完全相同同。也有有人利用用六鄰體體蛋白的的一個結結構部分分pIXX進行亞亞型的鑒鑒定，ppIX是是14.3KDDa六鄰鄰體很小小的組成成蛋白，它位于于每個六六鄰體殼殼粒的中中間，CC末端序序列暴露露在殼粒粒表面，N末端端伸向殼殼粒內部部，

29、pIIX的作作用是作作為一個個粘性因因子連接接六鄰體體六鄰體體，而且且它在DDNA包包裝的過過程中也也起到重重要作用用。pIIX的核核甘酸序序列在不不同的亞亞型間表表現(xiàn)出明明顯的差差別。有有研究小小組設計計特異的的引物，應用聚聚合酶鏈鏈反應(PCRR)，可可以是全全部的ppIX基基因以亞亞型特異異的方式式進行擴擴增，說說明利用用pIXX進行PPCR分分析，有有助于腺腺病毒亞亞型的鑒鑒定223,224。另據(jù)研究究發(fā)現(xiàn)，在這幾幾個中和和抗原決決定簇所所在的幾幾個超變變區(qū)HVVR1、HVRR2、HHVR44、HVVR5、HVRR7當中中,發(fā)生生了廣泛泛的染色色體的非非正常重重組，包包括短的的直接重重

30、復序列列的缺失失、插入入、重疊疊。而且且Ad血血清型的的進化是是由于在在HVRRs中發(fā)發(fā)生了染染色體非非正常的的重組(抗原性性遷移)，并伴伴隨有單單一堿基基的突變變。HVVRs的的重組又又形成了了獨特的的新的血血清型，這種獨獨特的血血清型由由組成中中和抗原原決定簇簇的殘基基的數(shù)目目、位置置、生物物學特性性所決定定。五、六鄰鄰體的免免疫學反反應為了研究究腺病毒毒衣殼的的三個主主要成分分所引起起的免疫疫反應，將復制制缺陷型型腺病毒毒（Reec-AAd）注注射到BBALBB/C小小鼠體內內進行研研究。實實驗結果果表明，采用不不同的免免疫方式式，產生生的免疫疫反應有有所不同同。通過過iv途徑徑進行免免

31、疫，產產生annti-Fi(抗纖維維)、aantii-Pbb(抗五五鄰體)、annti-Hx(抗六鄰鄰體)的的抗體；通過iip途徑徑進行免免疫，則則可以產產生annti-Hx抗抗體。由由此表明明腺病毒毒有三個個結構性性抗原25，抗體體可以與與其結合合，發(fā)生生感染性性失活：這些抗抗原分別別是纖維維、五鄰鄰體、六六鄰體。Antti-FFi抗體體的作用用主要是是聚集病病毒體；Antti-ppb抗體體的中和和作用是是阻斷酸酸性細胞胞進入細細胞漿；Antti-HHx抗體體，既可可以通過過聚集病病毒體起起中和作作用又可可以在低低PH值值（PHH5.00-PHH6.00）下部部分抑制制病毒體體的構象象改變，

32、從而中中和病毒毒體226。病毒的的六鄰體體包膜在在最初的的感染階階段起著著很大的的作用，在PHH值降低低的情況況下，六六鄰體蛋蛋白發(fā)生生構象的的改變，暴露出出分子的的N-端端。PHH值誘導導的六鄰鄰體構象象的改變變，對于于以后五五鄰體基基底的暴暴露，或或是參與與病毒體體脫去包包膜是很很必要的的277。19833年，有有研究人人員認為為六鄰體體蛋白為為型特異異性抗原原決定簇簇，是中中和抗原原的靶點點，是病病毒體對對免疫選選擇壓力力最敏感感的部分分。它的的特異型型很可能能氨基酸酸的靶序序列決定定288。為了研究究不同腺腺病毒六六鄰體的的抗原決決定簇的的組成，應用661個小小鼠腹水水（包含含Mabb

33、），分分為三組組進行。其中不不同的抗抗原決定定簇的分分布和標標志由MMab進行識識別。在在研究抗抗原決定定簇組成成的過程程中，反反應型和和所有的的61個個Mabb的滴度度間接由由ELIISA來來確定29。由MMab識別別的抗原原決定簇簇是六鄰鄰體型特特異性抗抗原決定定簇。用用Mabb來區(qū)分分21個個不同的的六鄰體體，這661個MMab用交叉叉反應類類型和滴滴度的相相關系數(shù)數(shù)進行處處理，由由此識別別出255個抗原原決定簇簇類型，而且型型特異性性表位只只存在于于同源六六鄰體的的表面30。有研究表表明，aantii-Hxx抗體有有著極強強的中和和反應，而且aantii-Fii和antti-ppb抗體

34、體在annti-Hx抗抗體所獲獲得的中中和反應應上有著著協(xié)同效效應，而而且在由由iv中可可以引起起最強的的中和反反應活性性。Annti-Fi抗抗體雖然然存在，但是它它們不能能有效的的阻斷病病毒感染染，所以以說纖維維蛋白不不是一個個很強的的中和抗抗原決定定簇，只只具有很很弱的免免疫原性性。腺病病毒的中中和抗原原決定簇簇主要在在于六鄰鄰體上，在當六六鄰體被被替代或或突變將將會導致致中和免免疫反應應的缺失失。因為為六鄰體體作為腺腺病毒的的主要結結構蛋白白，參與與各種各各樣的復復雜蛋白白的相互互作用31。有研究者者應用比比色法進進行中和和反應的的分析。用于定定量測定定Advv抗體的的血清學學滴度；在血

35、清清學的流流行病研研究中篩篩選型特特異性中中和抗體體。尤其其當抗體體的水平平低于550-880%時時，用比比色法來來確定低低水平感感染更為為有效。使用這這種方法法來大規(guī)規(guī)模地篩篩選血清清和Maab，以獲獲得存在在血清標標本中的的中和抗抗體值32。六、疫苗苗的研究究八十年代代，在軍軍隊中廣廣泛應用用Ad77作為減減毒活疫疫苗，來來預防呼呼吸道疾疾病和眼眼疾病33。有人人研究過過應用六六鄰體亞亞單位通通過陰離離子交換換層析純純化，以以獲得純純化的牛牛型腺病病毒型的六六鄰體免免疫刺激復復合體進進行免疫疫，它可可以在兔兔和牛體體內誘導導產生中中和抗體體。由此此表明BBAV-3六鄰鄰體可以以制備成成多價

36、亞亞單位疫疫苗，保保護牛抵抵抗多種種呼吸道道疾病34。目前國際際上主要要集中研研制腺病病毒的基基因工程程疫苗。病毒的的復制及及病毒基基因表達達的減少少，對于于開發(fā)活活疫苗和和用做基基因療法法的載體體是所必必要的。例如，細胞毒毒性基因因的失活活，對于于產生減減毒活疫疫苗是很很有意義義的335。在轉導導細胞內內減少病病毒基因因的表達達，可以以導致病病毒載體體安全性性增加。在腺病病毒體內內，病毒毒基因的的復制和和病毒基基因的表表達可以以通過轉轉換控制制因素，啟動子子的替換換來減少少。曾有有人通過過E4啟動動子的轉轉換，使使啟動子子功能減減少，減減少病毒毒后期基基因的表表達。在在H12229細細胞內，

37、通過EE4啟動動子的替替換而構構建的載載體，所所誘導表表達的纖纖維，與與野生型型相比，大大減減少336。隨著分子子生物學學技術的的開展，對腺病病毒的基基因工程程疫苗的的研究也也開展了了起來。國際上上，有人人應用AAd2的looop1區(qū)區(qū)的抗原原決定簇簇在B組組苛薩奇奇病毒中中的表達達。以苛苛薩奇病病毒作為為載體，重組腺腺病毒六六鄰體蛋蛋白的LL1環(huán)，以使其其在HeeLa細細胞內穩(wěn)穩(wěn)定地表表達，所所表達的的蛋白，可以誘誘導產生生既抗腺腺病毒又又抗苛薩薩奇病毒毒的中和和抗體，進而研研制多價價的基因因工程疫疫苗337,338。七、病毒毒感染的的特異性性免疫（一）體體液免疫疫作用病毒的抗抗體可自自感染

38、者者血清中中檢出，因此較較早被發(fā)發(fā)現(xiàn)并進進行了較較深入的的研究。病毒感感染后最最先出現(xiàn)現(xiàn)的是IIgM類類特異抗抗體，一一般在感感染后223dd血清中中開始出出現(xiàn)339。以后則則出現(xiàn)IIgG類類抗體，并隨不不同病毒毒種類而而持續(xù)時時間長短短不等。一般經經粘膜感感染并在在粘膜上上皮細胞胞中復制制的病毒毒在局部部可誘生生IgAA類抗體體。特異異性抗體體可用于于診斷。在體內內，中和和抗體的的抗病毒毒作用至至為重要要。1、中和和抗體這這種抗體體能與病病毒結合合后消除除病毒的的感染能能力，故故在殺滅滅細胞外外的游離離病毒中中起主要要作用。其作用用機制是是改變病病毒表面面構型，或與吸吸附于易易感細胞胞受體的

39、的病毒表表位結合合，阻止止病毒吸吸附并侵侵入易感感細胞和和增殖。病毒與與中和抗抗體形成成的免疫疫復合物物更容易易被巨噬噬細胞所所吞噬、清除或或改變抗抗原遞呈呈途徑。有包膜膜的病毒毒表面抗抗原與中中和抗體體結合后后，激活活補體，可致病病毒裂解解。IggG、IIgM、IgAA三種不不同類型型免疫球球蛋白的的中和抗抗體具有有不同的的生物學學特性。由于IIgG分分子量小小，通過過胎盤，新生兒兒可具有有來自母母體的中中和抗體體而得到到約6個個月的被被動免疫疫保護期期。IggM因分分子量大大，不能能通過胎胎盤。如如在新生生兒血中中測得被被動特異異性IggM抗體體，可診診斷為宮宮內感染染。病毒毒感染后后最早

40、出出現(xiàn)IggM抗體體，故檢檢查IggM抗體體可作早早期診斷斷。IggA抗體體主要來來源于粘粘膜固有有層的漿漿細胞，存在于于粘膜分分泌液中中，在局局部免疫疫中起主主要作用用，?？煽勺柚共〔《镜木志植空衬つと肭?。2、非中中和抗體體 有有些抗體體是針對對有包膜膜病毒的的基質或或其中的的核蛋白白，有些些抗體是是針對病病毒表面面具有細細胞融合合功能的的酶或病病毒復制制酶等。因這類類抗原與與病毒入入侵易感感細胞不不相關，故相應應抗體無無中和作作用，但但有時具具有診斷斷價值。病毒抗抗體的診診斷方法法隨不同同病毒而而異。3、抗體體介導對對靶細胞胞的作用用 因因有包膜膜的病毒毒感染細細胞后，細胞膜膜可出現(xiàn)現(xiàn)病毒

41、編編碼的蛋蛋白，能能與相應應抗體結結合，在在補體參參與下裂裂解細胞胞；也可可通過抗抗體依賴賴性細胞胞介導的的細胞毒毒作用（ADCCC）裂裂解與破破壞病毒毒感染的的細胞。4、抗體體介導促促進作用用（ennhanncemmentt） 抗體與與某些病病毒結合合后，可可促進病病毒在感感染細胞胞中的復復制，如如登革病病毒、呼呼吸道合合胞病毒毒等。對對抗體增增強作用用的機制制還不明明確。實實驗發(fā)現(xiàn)現(xiàn)IgGG抗體有有促進作作用，而而IgMM抗體則則無此作作用，推推測可能能當抗體體與病毒毒結合后后，更多多的病毒毒進入巨巨噬細胞胞而增殖殖，在細細胞表面面出現(xiàn)的的病毒抗抗原激發(fā)發(fā)了機體體的免疫疫應答。其中，巨噬細

42、細胞釋放放多種酶酶（如蛋蛋白激酶酶、凝血血酶等），進一一步激活活補體和和凝血系系統(tǒng)，釋釋放血管管通透因因子而引引起一系系列病理理變化而而發(fā)生嚴嚴重疾病病。（二）胞胞免疫作作用 對細細胞內的的病毒，機體主主要通過過CTLL及T細細胞釋放放的淋巴巴因子發(fā)發(fā)揮抗病病毒作用用。細胞胞免疫主主要在病病毒感染染的局部部發(fā)揮作作用，其其作用方方式為通通過免疫疫細胞接接觸靶細細胞后殺殺傷靶細細胞或在在局部釋釋放細胞胞因子，因此檢檢測細胞胞免疫的的技術較較體液免免疫為復復雜。1、殺傷傷性T細細胞（CCTL） CCTL的的殺傷性性作用具具有病毒毒特異性性，一般般出現(xiàn)于于病毒感感染后77d左右右。當CCTL活活性開

43、始始表現(xiàn)則則NK細細胞活性性逐步降降低。CCTL接接觸病毒毒感染的的細胞后后，特異異地識別別與MHHC分子子結合靶靶細胞表表面的病病毒抗原原特異肽肽段。在在識別中中還有一一些附加加因子如如CD33、CDD2和一一些粘附附分子等等。CTTL接觸觸靶細胞胞后被激激活并釋釋放穿孔孔素及細細胞毒素素，穿孔孔素是一一組酶的的統(tǒng)稱，其作用用類似補補體的CC9，致靶靶細胞出出現(xiàn)許多多小孔。細胞毒毒素可激激活靶細細胞內的的一些酶酶、細胞胞，或自自身裂解解，或發(fā)發(fā)生凋亡亡。在多多數(shù)病毒毒感染中中，因CCTL可可以殺傷傷靶細胞胞達到清清除或釋釋放在細細胞內復復制的病病毒體，從而在在抗體的的配合下下消除病病毒。因因

44、此被認認為是使使病毒感感染恢復復的主要要機制。2、輔助助性T（Th）細胞 Thh 細胞胞可以促促進B細細胞生長長與分化化，并活活化CTTL 及及巨噬細細胞。由由于在小小鼠中發(fā)發(fā)現(xiàn)有分分泌不同同淋巴因因子的TT細胞類類型，對對可分泌泌IL2和IIFN的T細細胞稱為為Th11類型，對分泌泌IL4，IIL55和ILL100的T細細胞稱為為Th22類型。在人類類亦有類類似的分分類，但但不如鼠鼠中明確確。在病病毒感染染中已發(fā)發(fā)現(xiàn)當患患者的TTh細胞胞有上述述類型的的轉換時時，病程程可以變變化，但但其機制制及意義義還有待待于對細細胞因子子在免疫疫網(wǎng)絡中中的作用用進一步步分析后后方可闡闡明。TTh細胞胞功能

45、低低下則可可影響機機體的抗抗體產生生及CTTL的作作用。3、細胞胞因子 在實實驗動物物及病毒毒感染者者研究中中發(fā)現(xiàn)，個別病病毒感染染后雖CCTL有有抗病毒毒作用，但并未未發(fā)生靶靶細胞死死亡的現(xiàn)現(xiàn)象。這這一現(xiàn)象象在神經經系統(tǒng)病病毒感染染，以及及乙型肝肝炎病毒毒持續(xù)感感染中已已被證實實，其機機制是由由于釋放放IFNN等細細胞因子子所致。有人稱稱這一現(xiàn)現(xiàn)象為非非溶細胞胞性T細細胞的作作用，即即通過CCD4T細胞胞在感染染病灶的的聚集，受特異異的病毒毒抗原所所激活，分泌大大量抗病病毒因子子（IFFN、TTNF）。這些些細胞因因子又可可進一步步激活TT細胞（CTLL，Thh細胞）、巨噬細細胞或甚甚至NK

46、K細胞，在抑制制病毒復復制及清清除靶細細胞內的的病毒協(xié)協(xié)同發(fā)揮揮作用。腺病毒六六鄰體蛋蛋白的LLoopp1、LLoopp2是較較好的中中和抗原原決定簇簇，本實實驗組已已經對這這段基因因的進行行了克隆隆、表達達并優(yōu)化化表達條條件，現(xiàn)現(xiàn)將其大大量表達達，純化化重組蛋蛋白，并并進一步步進行活活性鑒定定，用作作抗原動動物免疫疫，并檢檢測其所所產生的的抗體。通過中中和實驗驗檢測其其體外保保護情況況。應用用該方法法進行疫疫苗的研研制，將將是一種種安全、可靠、行之有有效的方方法。因因此本實實驗組針針對Looop11、Looop22區(qū)(六六鄰體抗抗原決定定簇所在在區(qū))的的基因工工程疫苗苗的研制制，將可可能成為

47、為未來高高效疫苗苗研制的的一個重重要手段段。前 言腺病毒(Adeenovviruus)是是DNAA病毒,可引起起多種疾疾病,如呼吸吸道感染染、流行行性角膜膜結膜炎炎、腹瀉瀉等。目目前已知知的人腺腺病毒有有41個血血清型,其中某某些型別別無論是是在成人人中還是是在兒童童中可引引起急性性呼吸道道感染的的現(xiàn)象已已經備受受關注 400、411 ,其中人人3 型腺腺病毒(Ad33)是引引起急性性呼吸道道疾病和和咽膜熱熱的常見見病原體體,嚴重者者可引起起支氣管管肺炎。20003年“非典”在我國國部分地地區(qū)流行行以來，給我國國人民生生命健康康和國民民經濟帶帶來了極極大的危危害，也也給人類類上了嚴嚴肅的一一課

48、。因因而，開開展對遠遠比冠狀狀病毒種種類多、宿主范范圍廣、感染途途徑多、致病性性強、病病死率高高、危害害嚴重的的腺病毒毒的預防防性研究究具有重重大的社社會意義義和經濟濟意義。預防傳染染性疾病病的最好好方法就就是疫苗苗，目前前，3、4、77型腺病病毒口服服減毒活活疫苗經經國外小小規(guī)模應應用已證證明有預預防效果果，但尚尚未大規(guī)規(guī)模生產產和應用用，國內內還沒有有相關報報道。基基因工程程疫苗正正在研制制過程中中。六鄰體是是腺病毒毒感染的的主要抗抗原蛋白白，其中中Looop1、Looop2區(qū)區(qū)是較好好的中和和抗原決決定簇，能夠刺刺激機體體產生相相應的抗抗體，抑抑制病毒毒體構象象的改變變，從而而中和病病毒

49、體，本實驗驗通過免免疫家兔兔，觀察察其狀態(tài)態(tài)變化，檢測其其血清中中抗體的的產生及及特異性性，并通通過體外外實驗驗驗證了其其具有保保護作用用，為今今后研制制高效、無毒的的腺病毒毒基因工工程疫苗苗奠定了了基礎。實驗材料料一、菌株株及病毒毒1、工程程菌大腸腸桿菌MM15ppQE331Heexonn本課題題組構建建422。2、Heela 細胞、人腺病病毒3型型病毒、M155菌株由由哈醫(yī)大大微生物物學教研研室保存存。二、主要要試劑盒盒1、SDDS-PPAGEE中分子子量標準準蛋白質質購自中中科院上上海生化化所。2、Nii-aggaroose層層析柱購購自QIIAGEEN公司司。3、DAAB顯色色試劑、羊

50、抗兔兔IgGG抗體購購自中山山生物制制品有限限公司。4、預染染Marrkerr購自中中山生物物制品有有限公司司。三、主要要試劑及及配制方方法（一）SSDS-PAGGE電泳泳所需試試劑1、122%SDDS-PPAGEE分離膠膠 10.0mllddHH2O 3.3 mml30%丙丙烯酰胺胺溶液44.0 ml1.5mmol/L Triis-ccl(ppH8.8)2.55 mll10%SDSS0.088 mll10%過硫酸酸銨0.08 mlTEMEED0.0088 mll2、5% SDDS-PPAGEE 積層層膠 3.0mllddHH2O2.11ml30%丙丙烯酰胺胺溶液00.5mml1.0 moll

51、/L Triis-ccl(ppH6.8)0.338mll10%SSDS00.033ml10%過硫酸酸銨0.03mmlTEMEED0.0033ml3、 330%丙丙烯酰胺胺溶液丙烯酰 300.0gg亞甲雙丙丙烯酰胺胺 0.88g離子水（ddHH2O） 1000.0mml4、100%過硫硫酸銨 1 gg過硫酸酸銨溶解解于100 mll的水中中，于44貯存。室溫、避光保保存。5、2XXSDSS凝膠加加樣緩沖沖液4 X Triis-HHCl/SDSS,Phh6.88(0.1mool/LL) 255ml 甘油油 20%（W/V） 200mlSDS 4%（W/VV） 4g溴酚蘭 00.0001%（W/VV

52、） 11mg加ddHH2O 至1100 ml并并混勻，等量分分裝成11ml于-70貯存。6、5XXTriis-甘甘氨酸電電泳緩沖沖液Triss堿155.1 gGlyccinee（pH 8.33）94.0 ggSDSS (電電泳極)5.0 gg加ddHH2O至10000 ml，使用時時1：55稀釋，室溫貯貯存。7、025%考馬斯斯亮蘭RR2500染液取考馬斯斯亮蘭RR25001.225 gg，溶解解在5000 mml甲醇醇：水：冰乙酸酸=455：455：100（體積積比）的的溶液中中，用wwhattmann 1 號濾紙紙過濾，于室溫溫保存。8、高濃濃度脫色色液 甲醇：水：冰冰乙酸=45：45：1

53、0（體積比比）混勻勻于室溫溫貯存。9、低濃濃度脫色色液甲醇：水水：冰乙乙酸=33：1：6（體積積比）混混勻于室室溫貯存存。 10、881 moll/L DTTT（二硫硫蘇糖醇醇）用20mml 00.011moll/L 乙酸鈉鈉溶液 （pHH5.22）溶解解3.009gDTTT，過濾濾除菌后后分裝成成1mll 小份份貯存于于-200（二） 純化試試劑1、 BBufffer B (裂解液液)磷酸二氫氫鈉 133.8ggTriss堿 11.2gg尿素 4880.55g加ddHH2O至10000 ml,用NaOOH調pH至8.00。2、Buuffeer CC (洗洗液)磷酸二氫氫鈉 13.8gTris

54、s堿 1.22g尿素 4800.5gg加ddHH2O至10000 ml,用NaOOH調pH至66.3。3、 BBufffer E （洗脫液液）磷酸二氫氫鈉 13.8gTriss堿 1.22g尿素 4480.5g加ddHH2O至10000 ml,用NaOOH調pH至4.55。（三）WWestternn-bllot所所需試劑劑1、 電電轉液 11L Glyycinne 22.9gg Triis堿 5.8g SDSS 0.37gg 甲醇 2200mml 用用ddHH20 定定容至11L2、 封封閉液（5%脫脫脂奶粉粉） 脫脂脂奶粉 55g PBBS 1000ml3、1%BSAABSA 11gPBS

55、1000mll4、PBBS (0.002M PPH7.4) 1L NNaCll 88gKCl 0.2g NNa2HPOO4.122H2O 3.6g KKH2PO4 0.224g dddH22O 8800mml定容至110000ml 調PHH至7.4(四)細細胞培養(yǎng)養(yǎng)液1、生長長液：1X16640培培養(yǎng)液 88% 胎牛牛血清 100% 雙抗抗（P、S） 1%用5.66% NNaHCCO3溶液調調pH至至7.22-7.42、維持持液：DMEMM液 96% 胎胎牛血清清 22% 雙雙抗（PP、S） 1%用5.66% NNaHCCO3溶液調調pH至至7.227.4(五)SSB培養(yǎng)養(yǎng)基及其其所需試試劑S

56、B 培培養(yǎng)基胰化蛋白白胨 200g酵母提取取物 100g 氯化鈉 10gg加去離子子水 9950mml并攪攪拌使之之完全溶溶解，用用5mool/LL的NaOOH調ppH值至至7.00，定容容至1LL，高壓壓蒸汽滅滅菌(115磅，1.0034105Pa)220330 mmin，4保存。 （六） 其它常常用溶液液1、1mmol/L HHCl按以下順順序混合合913.8mllH2O86.22ml濃鹽酸酸2、100moll/L NaOOH將4000g NaOOH溶于于4500 mll水中，補加水水到1LL，高壓壓滅菌。3、 00.5 moll/L EDTTA（乙乙二胺四四乙酸）稱取1886 gg ED

57、DTA溶溶于8000 mml去離離子水中中，加入入NaOOH調pH8.0，補補加水至至1L，高壓滅滅菌。4、500%甘油油50 mml甘油油，加水水至1000 mml，高高壓滅菌菌。5、100% SSDS 在 9000 mml水中中溶解1100 g SSDS，加熱助助溶，加加入濃鹽鹽酸調節(jié)節(jié)溶液的的pH 值值至7.2，加加水定容容至1LL，分裝裝備用。 6、 IIPTGG（異丙丙基硫代代-D半半乳糖苷苷）在8mll蒸餾水水中溶解解2gIPTTG后，用蒸餾餾水定容容至100ml，用用濾膜過過濾除菌菌，分裝裝成1mml小份份，-220貯存。7、1mmol/LTriss在8000ml 水水中溶解解

58、1221.11gTriis堿，加入濃濃鹽酸調調節(jié)pHH值至所所需值。PHHCCl77.470mml7.66 60mml 8.0 422ml應使溶液液冷至室室溫方可可最后調調節(jié)pHH值，加加水定容容至1LL，分裝裝后高壓壓滅菌。8、乙二二胺四乙乙酸鈉（EDTTA）用去離子子水溶解解EDTTA，濃濃度為00.022%，高高壓滅菌菌，分裝裝小瓶，于4ooC冰箱保保存。9、青/鏈霉素素儲存液液（1000000U/mmL青霉霉素和110mgg/mLL鏈霉素素）稱取1221mgg(16650UU/mgg)的青青霉素和和2000mg鏈鏈霉素，溶于220mLL去離子子水中，經0.22m 的的濾膜濾濾過除菌菌，

59、分裝裝并儲存存于220oC避光保保存。使使用時以以1:1000倍稀釋釋。四、主要要儀器設設備Heraaeuss Biiofuuge 17RRS 型型低溫高高速離心心機HITAA CHHI 低低溫高速速離心機機TLT-13VV-855V144 型超超低溫冰冰箱Minssk 16EE冰箱WS2-2611-799HW11型恒溫溫水浴箱箱HH.BB11-5000 型恒恒溫培養(yǎng)養(yǎng)箱ML-9902 型定時時恒溫磁磁力攪拌拌器Micrrofuuge Liite 離心機機THZ-C 恒恒溫震蕩蕩器Bio-RADD10000/5000 型電電泳儀ZF-44 型紫紫外透射射反射分分析儀LIBRROR HELL-2

60、000型電電子天平平UV-2265 風光光光度計，ShiimadduzuuQL-9901 型旋渦渦混合YJ-8875 醫(yī)用凈凈化工作作臺DT-BBI 型型脫色搖搖床Millli-QQ 型純純水器HW-88B 型型恒溫器器松下 NNN-KK5633S 微微波爐實驗方法法一、大量量誘導表表達目的的蛋白421、將重重組工程程菌M115/ppQE331heexonn接種在在含氨芐芐（1000ugg/mll）和卡卡那（550ugg/mll）的培培養(yǎng)基中中培養(yǎng)，同時設設空白菌菌M155作對照照，過夜夜培養(yǎng)。2、將菌菌液按11：500的比例例轉接到到8000ml LB培培養(yǎng)基中中，當菌菌液的OOD6000值