高效毛細(xì)管電泳法原理

1、高效毛細(xì)管電泳法原理第1頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四電泳，及其電泳技術(shù) 在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。利用電泳現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。第2頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四高效毛細(xì)管電泳（High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE） 簡(jiǎn)稱毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis，C

2、E），指以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和（或）分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種液相分配技術(shù)。CE是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。第3頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四基本裝置 CE 的基本裝置包括一個(gè)高壓支流電源、一根毛細(xì)管、一個(gè)檢測(cè)器及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。第4頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四高效毛細(xì)管電泳 高效毛細(xì)管電泳相對(duì)于經(jīng)典電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)： 一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管, 二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。 毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)

3、，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓可以很高；電壓升高，電場(chǎng)推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長(zhǎng)增加。 第5頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四界面化學(xué)電化學(xué)理論1.擴(kuò)散雙電層理論電動(dòng)電泳現(xiàn)象： 在外加電場(chǎng)作用下，溶膠中固液兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)；或者在外加力作用下，迫使固液兩相進(jìn)行相對(duì)移動(dòng)，又可以產(chǎn)生電勢(shì)差及兩相相對(duì)運(yùn)動(dòng)。這兩種相反的現(xiàn)象均與界面電勢(shì)差及相對(duì)運(yùn)動(dòng)有關(guān)。第6頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四固液兩相產(chǎn)生的原因1.固體表面從溶液有選擇吸附某種離子而帶電2.固體表面上的物質(zhì)粒子，在溶液發(fā)生電離。第7頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，

4、星期四 基本理論 在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場(chǎng)作用 下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移。遷移速度為： 試中Vep為離子電泳遷移速度， ep為電泳淌度，E為電場(chǎng)強(qiáng)度, q為離子電荷量，為介質(zhì)粘度，r為離子半徑。q6r EVep=ep E=第8頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四基本理論 CE所用的石英毛細(xì)管柱，在pH3時(shí)，石英毛細(xì)管壁上的硅醇基( SiOH）在水溶液中發(fā)生電離，產(chǎn)生的SiO負(fù)離子使毛細(xì)管壁內(nèi)表面帶負(fù)電，和溶液接觸時(shí)相應(yīng)的緩沖液帶正電，形成了雙電層。第9頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四基本理論 在高電壓作用下，雙電層中的水合陽(yáng)

5、離子引起流體整體朝負(fù)極方向移動(dòng)，該現(xiàn)象稱為電滲流（electro-osmotic flow, EOF）。 電滲流速度可表示為： 其中Veo為電滲流速度， eo 為電滲淌度， 為雙電層的Zeta電位， 為分離介質(zhì)的介電常數(shù) EVeo= eo E=第10頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四電滲流的特點(diǎn)1 具平面流型 其電滲驅(qū)動(dòng)力沿毛細(xì)管均勻分布，電滲速度的徑向分布幾乎是均勻的，它使整個(gè)流體像一個(gè)“塞子”一樣以均勻的速度向前運(yùn)動(dòng)，不會(huì)直接引起樣品組分區(qū)帶擴(kuò)散。 但在HPLC中，采用的壓力驅(qū)動(dòng)方式使柱中流體呈拋物線型，其中心處速度是平均速度的兩倍，導(dǎo)致溶質(zhì)區(qū)帶本身擴(kuò)張，引起柱效下

6、降，使其分離效果不如CE。第11頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四分離原理 粒子在電解質(zhì)溶液中的遷移速度等于電泳和電滲流兩種速度的矢量和,即V=Vep+Veo=(ep + eo ) E 正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致，故最先流出；中性粒子的電泳速度為0，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出。這樣，各種粒子因遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)了分離。第12頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四分離原理第13頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四毛細(xì)管柱 毛細(xì)管柱是

7、CE的核心部件，目前多為2575m之間，材料為聚四氟乙烯、玻璃和彈性石英，以石英居多。 選擇細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管柱有利于最大散熱，但比表面積大，會(huì)增加溶質(zhì)的吸附作用。第14頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四分離模式 毛細(xì)管電泳根據(jù)分離機(jī)理不同，具有多種分離模式，能夠提供互不相關(guān)而又互相補(bǔ)充的信息。 毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC）毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）毛細(xì)管等速電泳（CITP）毛細(xì)管電色譜（CEC）毛細(xì)管電泳第15頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE） CZE又稱毛細(xì)管自由電泳，是毛細(xì)

8、管電泳中最基本、應(yīng)用最普遍的一種模式。它在毛細(xì)管中僅填充緩沖液，基于溶質(zhì)組分在電場(chǎng)中的遷移速度不同而分離。前述的基本原理即是CZE的基本原理。第16頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC） 毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)巧妙結(jié)合的分離新技術(shù)，也是毛細(xì)管電泳中唯一能同時(shí)分離中性物質(zhì)和離子型物質(zhì)的分離模式。 第17頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四分離原理 MECC是在緩沖液中加入表面活性劑，當(dāng)其濃度高于臨界濃度時(shí)形成膠束。在電場(chǎng)力的作用下，毛細(xì)管水相可看作流動(dòng)相，膠束相可看作“準(zhǔn)固定相”，溶質(zhì)由其在膠束相和水相中的分

9、配系數(shù)不同而在不同時(shí)間流出。第18頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四儀器第19頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四特點(diǎn)與HPLC相比，CE的特點(diǎn)是： （1）分析速度快，柱效高； （2）幾乎不消耗溶劑，樣品用量?。?（3）前處理簡(jiǎn)單，甚至無(wú)需前處理； （4）可自由選擇被分離物質(zhì)的類型，使 圖譜清晰 （5）毛細(xì)管容易清洗，不容易產(chǎn)生柱污染第20頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四當(dāng)然CE也存在許多不足之處：（1）靈敏度和線性范圍不如HPLC（2）僅能夠?qū)崿F(xiàn)微量制備（3）定量精密度稍低于HPLC第21頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，20點(diǎn)28分，星期四應(yīng)用 離子分析 體內(nèi)藥物分析 中藥分析 手性拆分 蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸分析 DNA、RNA分析 抗生素、維生素、糖類、單細(xì)胞分析第22頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月2