抗體檢測技術(shù)與類風(fēng)濕因子

1、抗體檢測技術(shù)與類風(fēng)濕因子第1頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三抗體檢測技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)放射免疫測定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測定 第2頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三凝集反應(yīng) 凝集反應(yīng)是指顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)的可見性現(xiàn)象。顆?？乖缤暾募?xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。凝集反應(yīng)中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。第3頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三沉淀反應(yīng)1、絮狀沉淀反應(yīng)2、環(huán)狀沉淀反應(yīng)3、雙向擴(kuò)散4、單向免疫擴(kuò)散第4頁，共32頁，2022年，5月20日

2、，13點(diǎn)29分，星期三雙向擴(kuò)散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價(jià)，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。第5頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三抗原抗體為單一體系時(shí)，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同： 抗原抗體為多體系時(shí)，出現(xiàn)的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。第6頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn) (ELISA) Enzyme linked immunosorbent assay 第7頁，共32頁，2022年，5月

3、20日，13點(diǎn)29分，星期三實(shí)驗(yàn)原理 ELISA利用了免疫反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性檢測抗原或抗體使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步驟進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)加底物顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析第8頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三方法類型 ELISA既可測抗原又可測抗體，根據(jù)試劑來源、標(biāo)本性狀以及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出不同類型的檢測方法： 1.直接法 2.間接法 3.雙抗體夾心法 4.雙夾心間接法第9頁，共32頁，2022年，5月20

4、日，13點(diǎn)29分，星期三第10頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三第11頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三第12頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4

5、) enzyme-linked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.第13頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三一、試劑及儀器準(zhǔn)備（一） 免疫吸附劑1.固相載體 要求： 吸附力強(qiáng) 能保持Ag或Ab活性 不參與化學(xué)反應(yīng) 第14頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 載體性能比較 要求：載體材料+、- 結(jié)果差別大 檢測方法：10ug/

6、L IgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測20孔的OD，要求CV10% 常用載體： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板第15頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三2. Ag或Ab：純度高、效價(jià)高、結(jié)合力高3. 免疫吸附劑(固相Ag或Ab)： 包被：將Ag或Ab固相化的過程 包被緩沖液 封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾第16頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三 酶結(jié)合物：1. 要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、標(biāo)記后穩(wěn)定2. 常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等

7、3. 底物：HRP可溶性底物及呈色： 鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍(lán)色(450nm) 5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm) 魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色： DAB：棕黃色 -萘酚：紅色 3-氧基-9-乙基卡唑：紅色 4-氯-1-萘酚：灰藍(lán)色AP可溶性底物及呈色： 對硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm) 4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光AP不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 堅(jiān)固紅和萘酚ASMX混合液：紅色 -半乳糖苷酶： 4-甲基傘基-半乳糖苷：熒光第17頁，共32頁，2022年，5月20日，13

8、點(diǎn)29分，星期三4. 酶結(jié)合物的制備： 戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽氧化法第18頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三（三）設(shè)備：酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀 指測讀ELISA光度計(jì)；針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì) 性能指標(biāo)：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性 優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確0.001，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達(dá)0.5%操作：室溫宜在15-30，使用前先預(yù)熱儀器15-30min，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀第19頁，共32頁，2022年，5月20日，13

9、點(diǎn)29分，星期三第20頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三用途Dr Dennis E Bidwell and Alister Voller created the ELISA test to detect various kind of diseases, such as malaria, Chagas disease, and Johnes disease. ELISA tests also are used as in in vitro diagnostics in medical laboratories. The other uses of ELISA inclu

10、de:detection of Mycobacterium antibodies in tuberculosisdetection of rotavirus in fecesdetection of hepatitis B markers in serumdetection of enterotoxin of E. coli in feces第21頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三WESTERN BLOT步驟：試劑準(zhǔn)備：1、SDS試劑:見電泳實(shí)驗(yàn)。2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；-巰基乙醇 0.2ml；dd

11、H2O 2.8ml。3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H2021.0l。 第22頁，共32頁，2

12、022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三樣品制備含量測定第23頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三SDSPAGE電泳第24頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三轉(zhuǎn)膜第25頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三免疫反應(yīng)第26頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三化學(xué)發(fā)光第27頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三類風(fēng)濕因子類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor,RF）可分為IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型（注：在臨床內(nèi)科學(xué)中描述為四型，沒有IgD型；但在實(shí)驗(yàn)室診斷學(xué)中描述為5

13、型），是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清中針對IgG FC片段上抗原表位的一類自身抗體，類風(fēng)濕因子陽性患者較多伴有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，如皮下結(jié)節(jié)及血管炎等。第28頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三類風(fēng)濕因子約90%類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的RF呈陽性。IgA-RF與骨質(zhì)破壞有關(guān)，早期IgA-RF升高常提示病情嚴(yán)重，預(yù)后不良；IgE-RF升高時(shí)，已屬病情晚期。某些自身免疫病，如冷球蛋白血癥、進(jìn)行性全身性硬化癥、干燥綜合征、SLE等患者都有較高的陽性率；一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出現(xiàn)RF。第29頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三類風(fēng)濕因子近年來對IgM型類風(fēng)濕因子的生物作用已有所了解，這些生物作用包括：1 、調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫反應(yīng)；2、激活補(bǔ)體，加快清除微生物感染；3、清除免疫復(fù)合物使機(jī)體免受循環(huán)復(fù)合物的損傷。第30頁，共32頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)29分，星期三類風(fēng)濕因子測定IgG、IgA、IgM類RF通常用ELISA間接法，即用熱凝集兔IgG包被反應(yīng)板微孔，加入檢樣后，再分別加抗人IgG、IgA、IgM酶標(biāo)記抗體，使反應(yīng)后再與底物呈色。為防止各Ig類別RF相互干擾，酶標(biāo)記抗體使用標(biāo)記的