核酸探針技術(shù)及應(yīng)用

1、核酸探針技術(shù)及應(yīng)用 生物學(xué)的進(jìn)展，應(yīng)用DNADNA雜交建立了核酸探針(Probe)技術(shù)，該技術(shù)是目前基因檢測最 常用的方法， 目前已成為診斷各種感染性疾病，惡性腫瘤，遺傳病，檢測抗生紊的耐藥性，法醫(yī)學(xué)鑒定及從分子水平上爭辯發(fā)病機(jī)制與流行病學(xué)規(guī)律等方面的一種重要手段 介紹了核酸探針技術(shù)的原理，核酸分子雜交方法及核酸探針的應(yīng)用等方面。一、核酸探針技術(shù)的原理DNA 或RNA 片段能識別特定序列基因的DNA種用同位素非同位素標(biāo)記的單鏈DNA片段即為核酸探針。核酸探針技術(shù)是將雙鏈DNAAT，GC堿基配對的原則重組合成雙鏈為復(fù)性。這種重組合只是在兩股DNA是互補(bǔ)(同源)或局部互補(bǔ)(局部同源)的條件下才能實(shí)

2、現(xiàn)。正是由于雙鏈DNA的這種可解離與重組合的性質(zhì)，才可用一條的單鏈DNA，用放射性同位素或其他方法標(biāo)記后制備成核酸探針，與另一條固定在硝酸纖維素濾膜上的變性單鏈DNA進(jìn)展雜交，(另一條DNA或其他顯色技術(shù)檢測，以確定有無與探針DNA (或RNA)同源或局部同源的DNA(或RNA)存在。由于探針只與靶病原體的DNA或RNA雜交，而不與標(biāo)本中存在的其他DNA 或RNA 雜交。二、核酸探針技術(shù)的根本方法被檢標(biāo)本用去污劑和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各種方法處理DNA使其變性，把DNADNA結(jié)合于固態(tài)基質(zhì)上，(如濾膜)使其固定。再加上DNAx影印者即為陽性。探針亦可用3H標(biāo)記，最終用液

3、閃計(jì)數(shù)器計(jì)致。還可用生物素，抗生物素等標(biāo)記，最終用酶標(biāo)法顯色，均能得到滿足效果。核酸探針的制備核酸探針可分為DNACDNARNA法也不同。DNA探針DNA探針可分為基因探針和基因片段探針。全基因組基因探針的制備最簡潔，只要將染色體DNADNA用限制性內(nèi)切酶酶(Ecoli)，篩選含特異目的基因片段的克隆株進(jìn)展擴(kuò)增，再提取基因片段作探針。CDNA探針通過提取純度較高的相應(yīng)mRNA或正鏈RNA病毒的RNA， 反轉(zhuǎn)錄成CDNA作為探針。也可以進(jìn)一步克隆在大腸桿菌中進(jìn)展無性生殖，再從重組質(zhì)粒中提取CDNA作探針。RNA探針有些雙鏈RNA病毒的基因組在標(biāo)記后， 可直接用作探針。另一種是從CDNA 衍生而來

4、的RNA探針， 可由很強(qiáng)的RNACDNA探針?biāo)患埃?由于RNARNA復(fù)合物比DNARNA復(fù)合物穩(wěn)定，所以其靈敏度可提高10倍以上。寡核苷酸探針用DNA合成儀可以合成50個核苷酸以內(nèi)的任意序列的寡核苷酸片段，以此作為核苷酸探針，也可將它克隆到M 系統(tǒng)中使之釋放含探針序列的單鏈DNA，使探針的制備和標(biāo)記簡化。13核酸探針的標(biāo)記核酸探針過去承受放射性同位素進(jìn)展標(biāo)記，常用標(biāo)記物有32P dNTP，35S dNTP等。同位素的選擇是依檢測類型而定，制就的DNA探針先經(jīng)加熱變性成單鏈后再與固定于硝酸纖維素膜上的待測DNA雜交，如為同源則與之結(jié)合，經(jīng)放射自顯髟后，膜上消滅黑色區(qū)。放射性同32P代替磷原予不

5、轉(zhuǎn)變堿基空間構(gòu)造，所以不影響雜交反響的動力學(xué)曲線。其缺點(diǎn)是半衰期短射性物質(zhì)有金屬(如汞)，半抗原(如地高辛)，生物素。 和酶等，應(yīng)用較多的是生物素。非放射性標(biāo)記的特點(diǎn)是保存時問長， 檢測時使用便利，其最大缺點(diǎn)是靈敏度一般比放射性同位素低，但最近報(bào)道用化學(xué)發(fā)光物吖啶酯直接標(biāo)記DNA探針，用化學(xué)發(fā)光儀檢測雜交體，其靈敏度超過放射性同位素標(biāo)記的探針可能是將來核酸探針分析技術(shù)的進(jìn)展方向。在這里介紹一種非放射性標(biāo)記“生物素核酸探針” ，其根本原理為：生物素(Biotin)是一種B族維生素，能與抗生素蛋白親和素(Avidin)或鏈霉親和素(Streptavidin)特異性結(jié)合，其解離平衡常數(shù)(K10-5D

6、。每個生物素分子由四個一樣亞基組成，每個亞基都能專一性地識別一個生物素分子的脲基環(huán)局部被生物素所標(biāo)記的目標(biāo)，然后檢測熒光或酶反響而檢待測目標(biāo)。標(biāo)本處理首先從標(biāo)本中提取DNADNA可用DNA用一支包裝的小柱于30分鐘內(nèi)快速提取DNA的儀器。標(biāo)本經(jīng)快速過柱后，到達(dá)純化，DNA 加熱變性使成單鏈 (RNA是單鏈勿需予先變性)實(shí)行標(biāo)本可能是未知病原體懸液糞便標(biāo)本等。目前已進(jìn)展了不需抽提核酸而直接在細(xì)胞裂解液中進(jìn)展檢測的方法DNA分且簡潔把握，國外在愛滋病的病毒檢測中已應(yīng)用這種方法對血細(xì)胞進(jìn)展處理。樣品處理要考慮的另一個問題是待測樣品中目的序列的含量或總的核酸量 低必定會影響檢測的靈敏度。解決的方法是用

7、聚合酶鏈?zhǔn)椒错?PCR)的方法，它能在體外通 過DNA 聚合酶將目的序列的拷貝數(shù)特異地快速擴(kuò)增1O5107倍，使標(biāo)本中目的序列的含量大PVCR法已廣泛應(yīng)用于DNA 傳染病的早期診斷和法醫(yī)物證鑒定中均取得了滿足的結(jié)果。核酸分子雜交核酸分子雜交(nucleic acid bybridization)是指標(biāo)記的單核苷酸和所需檢測的目的單鏈核酸通過堿基配對相互結(jié)合的過程。假設(shè)為雙鏈核酸則事先需要變性， 使之翻開成單鏈。 雜交是直接將目的序列和探針在溶液中進(jìn)展雜交和檢測由于不需從溶液中分別出雜交體， 因而使檢測周期大為縮短，是目前最簡潔的雜交程序。固相雜交固相雜交是將欲檢測的核酸樣品先結(jié)合到某種固相支持

8、物上交技術(shù)有以下幾種。印記雜交此法包括了DNA 轉(zhuǎn)移雜交法(Southern印跡法)和RNA轉(zhuǎn)移雜交(Northern印跡法)。DNA 轉(zhuǎn)移雜交法(Southern印跡法)先分別DNADNA按分子DNA31P標(biāo)記的DNA 探針進(jìn)展DNA桉酸片段分子量的大小。RNA轉(zhuǎn)移雜交(Northern印跡法)是分析RNA(主要是mRNA)的分子雜交技術(shù)。其原理是與DNA轉(zhuǎn)移雜交相像，不同的是RNA 轉(zhuǎn)移雜交是在變性劑存在下進(jìn)展凝膠電泳分別RNA或mRNA，變性劑是防止RNA 分子二級構(gòu)造發(fā)生卡環(huán)的形成，保持其單鏈線型狀態(tài)。電泳分別后，將凝膠上RNA帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再以探針與之雜交。膜雜交法通過狹縫

9、印跡(Slotblot)、Soutbernblot、Northemblot或轉(zhuǎn)種點(diǎn)膜法固定到膜上的DNADNA和合成聚合物將膜上非 特異DNA依據(jù)探針要求，承受不同漂洗條件可先洗去未雜交探針。細(xì)胞內(nèi)原位雜交法(原位分子雜交法)用同位素或非同位素標(biāo)記的探針對感染細(xì)胞或包埋組織中的病毒核酸變性后進(jìn)展雜交， 然后用放射自顯影或酶催化顯色法或免疫熒光法進(jìn)展檢測 。使用同位素標(biāo)記核酸探針作細(xì)胞系統(tǒng)，可直接在顯微鏡下觀看結(jié)果，它不僅可用于細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)爭辯， 還可用于其他方面。斑點(diǎn)分子雜交法將已經(jīng)加熱或堿處理變性的待測DNA 直接滴于硝酸纖維素濾膜上，(或?qū)⑵渲苯狱c(diǎn)在濾膜上再加熱或堿處理變性)用 32P或

10、125I標(biāo)記的DNA者，經(jīng)放射自顯影可直接觀看。此法簡便、快速，已廣泛應(yīng)用于檢測各種病毒核酸。夾心雜交可有效地排解雜質(zhì)干擾，提高探針檢測的特異性。液相雜交液相雜交是指待檢測的核苷酸樣品和核酸探針同時溶于雜交液中進(jìn)展反響交的雙鏈和未參與反響的單鏈核酸包括未結(jié)合的探針。用儀器檢測并通過計(jì)算分析雜交結(jié)果。液相雜交速度快，但它的缺點(diǎn)是不易分別游離和雜交的探針，給常規(guī)應(yīng)用帶來困難。三、核酸探針技術(shù)在實(shí)際中的應(yīng)用狀況 在檢測抗生素的耐藥性、流行病學(xué)調(diào)查、惡性腫瘤、遺傳病、法醫(yī)學(xué)鑒定、食品衛(wèi)生及獸醫(yī)等方面也已應(yīng)用。在病原微生物的檢測方面 DNA 重視。目前，EB病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、腺病毒、乙型肝

11、炎病毒、人類免疫缺陷病毒等50 毒、皰疹病毒、牛羊藍(lán)舌病病毒、綿羊的梅迪維斯納病毒、豬偽狂犬病毒、禽敗血支原體和滑膜支原體等動物病原微生物的核酸探針也開頭用于臨床。在遺傳性疾病及點(diǎn)突變的直接分析方面DNA分子中某個堿基的替換或核苷酸的插入缺失及重排都可能引起遺傳性疾病。一般可以依據(jù)遺傳疾病可用DNA雜交技術(shù)進(jìn)展分析。對于那些基因點(diǎn)突變引起的限制性內(nèi)切酶作用部位增加或DNADNA長度發(fā)生轉(zhuǎn)變而引起的遺傳疾病可用DNADNA酸鏈和給定的等位基因之間的一個堿基對的錯配來鑒別基因型(這個等位基因在此條件下完全不能雜交)。這種方法已用于分析一抗胰蛋白酶缺陷、鐮狀細(xì)胞貧血。此外人的性別鑒定和法醫(yī)學(xué)上人的DNA指紋分析，也廣泛應(yīng)用核酸探針診斷技術(shù)。在其他方面的應(yīng)用檢測抗生素耐藥性核酸探針可直接從標(biāo)本中測出細(xì)菌的耐藥基因 Perine等用DNA探針查出尿路滲出液中的大多數(shù)淋球菌含有TEM 型一內(nèi)酰胺酶而對青霉素G耐藥。流行病學(xué)調(diào)查探針可用于爭辯醫(yī)源性感染中爆發(fā)流行時大量的流行菌株間的同源性解釋。惡性腫瘤癌基因，