流式細胞術(shù)鑒定超微量免疫細胞樣本

1、使用CD115來鑒定和分析小鼠血中單核細胞12月2日1血中的單核細胞白血球細胞 (leucocyte)：粒細胞和非粒細胞粒細胞（多形核白細胞）: 中性粒細胞，嗜堿性粒細胞，嗜酸性粒細胞 非粒細胞 （單核白細胞）：淋巴細胞，單核細胞和巨噬細胞背景介紹GKoenderman L et al. J Leukoc Biol 2000;68:58-642背景介紹縱向小鼠模型（非致死）: 重要性：可用于預(yù)測疾病風(fēng)險的增加，縱向評估病情的進展 需求：觀察小鼠模型個體在外界刺激或者藥物反應(yīng)中的長期變化 困難：每次可采集的小鼠血液樣本體積非常小小鼠單核細胞標記(占血液中細胞總數(shù)3%)CD11b: 表達在多種細胞

2、表面 （髓樣細胞，NK細胞， 活化的T細胞，B細胞 ）CD14: 表面表達量低或檢測不到常用3-由此,需要建立有效的實驗方案建立小鼠縱向模型，需要一種流式細胞儀， 可檢測超微量血液樣品 同時又需保證重復(fù)性，數(shù)據(jù)準確更加可行的單核細胞標記，用于FACS:CD115- 細胞表面標記本身具有穩(wěn)定性, 在檢測微量血液樣品體積時，測試結(jié)果具有一致性提出的問題及實驗的設(shè)計VS4小鼠血樣的采集 CD-1 雄性小鼠,大隱靜脈取血（每次采樣0.5%體重，非致死方式）材料與方法實驗 1: 比較常用的小鼠單核細胞表面標記 (Guava easyCyte Mini)實驗 2: 鑒定不同單核細胞表面標記的穩(wěn)定性A: 維

3、持的時間長度B: 不同的激光強度(Guava EasyCyte Mini20mW; Guava easyCyte 6HT-2L40mW)C: 不同的抗凝劑實驗 3: 確定可用于檢測的最小血樣體積(40ul、20ul、10ul、5ul)5結(jié)果 1比較小鼠單核細胞的表面標記 （CD115 vs CD11b，CD14）95% CD115陽性細胞: 共表達CD11b+85% CD115陽性細胞: 共表達CD14+ 如以CD115選取細胞群CD11b及CD14陽性率 差異小650% CD11b陽性細胞:共表達 CD11570% CD14陽性細胞: 共表達 CD115如以CD14與CD11b選取細胞群CD

4、115陽性率 差異大結(jié)果 1比較小鼠單核細胞的表面標記 （CD11b，CD14 vs CD115）795% CD115+: CD11b+85% CD115+: CD14使用CD115+ 設(shè)門選取細胞群觀察 CD11b與CD14CD115所選取的細胞群亦表現(xiàn)在CD11b及CD14陽性區(qū)域結(jié)果 1比較小鼠單核細胞的表面標記 （CD115 與 CD11b，CD14）8鑒定單核細胞表面標記CD115的穩(wěn)定性-A:維持的時間長度 0hr 2hr 4hrCD115:33% 降低CD11b:6.5% 降低結(jié)果 29easyCyte Mini: 20mWeasyCyte 6HT-2L:40mW更強的激光強度，

5、更高的 gMFI但信號的降低程度一致 (33%)結(jié)果 2鑒定單核細胞表面標記CD115的穩(wěn)定性-B:不同的激光強度10EDTA 4-8度（RT）更加穩(wěn)定結(jié)果 2鑒定單核細胞表面標記CD115的穩(wěn)定性-B:不同的抗凝劑11確定可用于檢測的最小血樣體積單核細胞總量: CD115+經(jīng)典單核細胞: CD115+ Gr-1high 非經(jīng)典單核細胞: CD115+ Gr-1low800060003500200040,20,10ul:差異性 10% 5ul:每次取樣，單核細胞分亞型檢測時差異大因此,10ul 不推薦！用于分析單核細胞的亞型結(jié)果 312結(jié)論細胞表面標記：選擇CD115抗體鑒定本身雖具有不穩(wěn)定性，但相比傳統(tǒng)的表面標記選取單核細胞群更加準確(時間控制, EDTA+冰上, 強的激光強度) 實驗對象：小鼠縱向（非致死）模型確保了非致死取血的可能性據(jù)此建立小鼠模型可檢測個體變化(=0.5% 的小鼠體重：可兩周取一次, =0.05% 的小鼠體重：每天取) 檢測平臺：高性能超