流式細胞儀在臨床檢測和臨床科研中應(yīng)用

1、流式細胞儀在臨床檢測和臨床科研中的應(yīng)用李 柏 青1流式細胞儀和流式細胞術(shù)概述流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)流式細胞儀在臨床檢測和科研中的應(yīng)用免疫學(xué)檢測和科研應(yīng)用血液病檢測和科研應(yīng)用腫瘤學(xué)檢測和科研應(yīng)用流式細胞儀的基本工作原理以及在基礎(chǔ)和臨床科研中的應(yīng)用2一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞儀(Flow Cytometer， FCM):是集合光電子物理，光電測量技術(shù)， 液流技術(shù)，計算機技術(shù)等現(xiàn)代高科技技術(shù)為一體的細胞測量和分析儀器。3一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)的基本概念流式細胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM):是應(yīng)用流式細胞儀，對處于快速流動液體中的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快

2、速測量和定量分析，以及分選的技術(shù)。4一、流式細胞儀和流式細胞術(shù)特點多參數(shù)測量和分析（散射光和熒光） ；快速測量和分析每秒可達1000-10000個細胞分選純度可達99%以上。獲取的數(shù)據(jù)分析結(jié)果更具有統(tǒng)計學(xué)意義；通常測量的對象如各種細胞細胞必須處在單個細胞懸液中。此外，也可測量微生物等生物顆粒，或者工合成微球非生物顆粒，5臺式機FACSCalibur雙激光 488nm 635nm四熒光參數(shù)分選、濃縮系統(tǒng)67大型機FACSVantage SE科研型八熒光參數(shù)高速分選多路分選8 流式細胞儀與熒光顯微鏡比較 流式細胞儀 熒光顯微鏡 流動的細胞 靜止的細胞樣本 數(shù)量大 數(shù)量少 高速分選 樣本難以再利用

3、細胞群體特征量分布 可揭示細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息9二、流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)光路系統(tǒng)： 激光光源，光路系統(tǒng)（透鏡、濾光片）電子系統(tǒng)：光電倍增管（PMT），補償電路液流系統(tǒng)： 鞘液系統(tǒng)，樣品流動系統(tǒng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)：計算機，數(shù)據(jù)測量和分析軟件。細胞分選系統(tǒng)（一） 流式細胞儀的結(jié)構(gòu) 10流式細胞儀光路系統(tǒng)激光 (Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩(wěn)定光照激光波長: 488nm, 635nm光收集系統(tǒng)是由若干組透鏡, 濾波片, 小孔組成，將產(chǎn)生的光信號引導(dǎo)至檢測器11光路系統(tǒng)12Injector Tip13Injector TipFluorescencesignalsFocus

4、ed laserbeamSheath fluid14流式細胞儀光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)光源與熒光標(biāo)記物15光學(xué)檢測信號16流式細胞儀的光學(xué)系統(tǒng) FACSCalibur17流式細胞儀液流系統(tǒng)18液流系統(tǒng)：鞘液系統(tǒng)樣品流動系統(tǒng)19流式細胞儀的電子系統(tǒng) 信號檢測和分析當(dāng)細胞攜帶熒光素, 通過激光照射區(qū), 受到激發(fā)產(chǎn)生不同波長的、代表細胞內(nèi)不同物質(zhì)的熒光信號熒光信號由光電接收器接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖信號，電脈沖信號經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號數(shù)字信號傳送到計算機，進行儲存、作圖和統(tǒng)計分析20數(shù)據(jù)系統(tǒng)21（二） 流式細胞儀可檢測的細胞參數(shù)細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞顆粒性程度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量細胞功能

5、細胞表面蛋白抗原細胞胞漿內(nèi)蛋白性抗原細胞內(nèi)細胞因子細胞增殖細胞內(nèi)鈣離子濃度二、流式細胞儀的工作原理和測量參數(shù)22（二） 流式細胞儀可檢測的細胞的參數(shù)： 散射光信號前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 入射光的前向 (5)散射光信號, 可反映：細胞相對大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter） 入射光90角的散射光信號， 可反映：細胞顆粒性程度 （胞內(nèi)成分和構(gòu)造和表面結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性）23散射光信號前向角散射光FSCFALS SensorLaser24散射光信號側(cè)向角散射光SSCFALS Sensor90LS SensorLaser25流式細胞的基本信息:

6、 “形態(tài)”2627外周全血細胞（紅細胞溶解后） 以散射光表示的 雙參數(shù) 點圖28外周全血細胞（紅細胞溶解后） 以散射光表示的 雙參數(shù) 點圖中性粒細胞單核細胞淋巴細胞29（二） 流式細胞檢測細胞參數(shù): 特征信息熒光（Fluorescence）信號熒光素吸收激光（激發(fā)光波長）能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為釋放較入射光波長更長的光量子（發(fā)射光波長）熒光素與特異抗體結(jié)合（熒光抗體）熒光抗體與細胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生熒光信號越強熒光素與細胞核酸結(jié)合，熒光強度反映核酸含量30（二） 流式細胞檢測細胞參數(shù): 特征信息熒光（Fluorescence）信號Forward scatter (FSC)Side sc

7、atter (SSC)FL1 （第一熒光） -FITC(異硫氰酸熒光素）FL2 （第二熒光） -PE（藻紅蛋白）FL3 （第三熒光） -PerCP, PeCy5等PL4 （第四熒光） -APC（藻青蛋白）31熒光信號FluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)3233熒光信號雙色直接染色34（三） 流式細胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形：（二維）點陳圖 (Dot Plot)適用于：雙參數(shù)分析35（三） 流式細胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形： 直方圖(Histogram Plot)適用于：單參數(shù)分析僅需要觀察某個熒光強度的變化36流式細胞術(shù)

8、檢測細胞的熒光 標(biāo)記方法單標(biāo)： 一種單抗 : FL1, FSC, SSC（三參數(shù)）雙標(biāo)： 兩種單抗：FL1, FL1, FSC, SSC（四參數(shù)）三標(biāo)： 三種單抗：FL1,FL2, FL3,FSC, SSC（五參數(shù)）四標(biāo)四種熒光標(biāo)記抗體：四種單抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六參數(shù)）37淋巴細胞亞群分析細 胞 凋 亡 腫瘤學(xué)移植免疫三 流式細胞儀在臨床檢測和科研中的應(yīng)用血小板其 它38淋巴細胞亞群分析39AdhesionMetabolic404142 T淋巴細胞淋巴細胞亞群檢測： T cells, T subsets, NK cells, B cells43淋巴細胞亞群T淋

9、巴細胞(CD3+)名 稱功 能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細胞免疫和體液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-輔助性T細胞(Th)誘導(dǎo)性T細胞(Ti)輔助細胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T細胞(Ts)殺傷性T細胞(Tc)抑制細胞和體液免疫細胞毒性T細胞CD3+CD4+CD8+活化的T細胞在T細胞惡性增生時升高 CD3+CD4-CD8- 有調(diào)節(jié)功能的T細胞,其表達 / T細胞受體(TCR / ) C

10、D4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO- 幼稚的/靜止的T淋巴細胞 當(dāng)免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細胞毒性淋巴細胞的祖細胞時此細胞亞群較低 CD45RA-CD45RO+ 記憶性T淋巴細胞 病菌感染時升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T細胞, 感染時升高 感染時升高44淋巴細胞亞群活化T淋巴細胞名 稱功 能CD3+HLA-DR+活化T細胞CD4+HLA-DR+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞CD4+CD25+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+

11、活化的抑制性/殺傷性T細胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差B淋巴細胞(19+)CD19+CD23+ 活化的B細胞過敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B細胞白血病及單克隆B淋巴細胞 NK細胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時降低, 而病毒感染時升高 CD3+CD57+CMV(巨細胞病毒)感染的強烈征兆 45淋巴細胞亞群與疾病疾 病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 自身免疫性溶血性貧血 重癥肌無力免疫缺陷病 愛滋病病毒感染 傳染性單核細胞增多癥慢性活動性肝

12、炎活動性肝硬化腫瘤 消化道癌, 肝癌, 肺癌再生障礙性貧血粒細胞減少癥46淋巴細胞亞群檢測意義疾病機理研究 疾病輔助診斷移植后免疫檢測治療方案的確定及療效評價CD25高于正常值5-10%, 表明即將或已發(fā)生排斥CD4/CD8比值下降提示并發(fā)兇險感染 0.2時, 必須停用免疫抑制劑CD2+HLA-DR+增加5-10%, 且不伴有CD25的增加, 提 示巨細胞病毒感染慢性疲勞, 感染后綜合征, 纖維肌痛, 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎, 過敏等 疾病預(yù)防47淋巴細胞亞群檢測意義Control （n=20)Active SLE (n=17)Stable SLE (n=13)CD370.4 5.8765.8 10.

13、968.5 8.95CD435.0 5.7022.1 4.15*34.5 4.23CD827.9 5.7345.7 9.58*32.7 9.01CD4/CD81.27 0.140.43 0.12*1.05 0.26*NK17.8 5. 484.37 3.31*7.59 5.01*鑒別活動期和非活動期SLE48HIV AND AIDS49Th1/Th2細胞50Th1/Th2細胞Th1型細胞因子介導(dǎo) 細胞免疫反應(yīng)引起遲發(fā)型過敏反應(yīng)、巨噬細胞活化、局部炎癥刺激來源：病毒、某些細菌Th2型介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)引起B(yǎng)細胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、促進I型變態(tài)反應(yīng)（過敏反應(yīng)）刺激來源：多細胞寄生蟲、過敏原5

14、1Th1/Th2細胞PMA+Ionomycin 刺激4-6hr52流式細胞儀檢測胞內(nèi)細胞因子 新鮮分離PBMC 加PMAIo刺激后6h測定胞內(nèi)細胞因子IL-4和IFN-g 檢測免疫細胞表型和結(jié)合檢測胞內(nèi)細胞因子： 操作和分析方法； 53四色標(biāo)記胞內(nèi)因子FCM檢測54Th1/Th2失衡相關(guān)疾病嗜酸性細胞增多和IgE升高相關(guān)疾病 Ommens Syndrome(Ommens綜合征) Hyperosinophilic Syndrome(高嗜曙紅細胞綜合征) Kimuras Disease(Kimuras疾病) Wells Syndrome(Wells 綜合征)傳染病 病毒性疾病 人類免疫缺陷性病毒感

15、染和愛滋病(AIDS) 麻疹 呼吸道合胞體病毒感染 慢性活動性乙型肝炎病毒感染 分枝桿菌和其它細菌感染 麻瘋病/肺結(jié)核 鳥結(jié)核分枝桿菌復(fù)合感染 滑膜炎反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎 淋病和梅毒55Th1/Th2失衡相關(guān)疾病寄生蟲病 原寄生蟲感染：皮膚和內(nèi)臟利什曼病 蠕蟲?。航z蟲病和血吸蟲病真菌性疾病 過敏性支氣管肺霉菌病 念珠菌病 隱球菌病 類球孢子菌病 球孢子菌病 組織胞漿菌病惡性腫瘤 皮膚基底細胞和鱗細胞癌 Sezary Syndrome (Sezary綜合征) 淋巴瘤 EBV相關(guān)的B細胞和非何杰金氏淋巴瘤 何杰金氏淋巴瘤 大細胞退行性(CD30+)淋巴瘤 多發(fā)性骨髓瘤和Castlemans綜合征 卡氏肉瘤

16、56Th1/Th2失衡相關(guān)疾病變應(yīng)性疾病 皮膚性哮喘 變應(yīng)性哮喘 春季結(jié)膜炎炎性和自身免疫性疾病 巨細胞(暫時性的)動脈炎 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 自身免疫性甲狀腺疾病 類肉瘤病 銀屑病(牛皮癬) IgA腎病 多發(fā)性硬化57Th1/Th2細胞檢測意義疾病治療發(fā)病機制研究使用Th1和Th2相關(guān)的細胞因子 IFN-治療麻瘋病 用抗Th1和Th2相關(guān)細胞因子或其受體的抗體 抗IL-4抗體治療真菌和寄生蟲感染 使用調(diào)節(jié)Th2/Th2細胞因子平衡的藥物: 薩力多胺(Thaliodomide) 治療巨細胞動脈炎疾病治療監(jiān)測58 腫瘤學(xué)59腫瘤發(fā)生發(fā)展600 200 400 600 8001000P

17、I 熒光強度(DNA含量)DNA含量分析2N4NCountsG0/G1G2/MS異倍體61DNA含量分析70%人類癌癥中存在著異倍體或細胞周期的改變1. Ross JS. DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology. New York: Igaku-Shoin;1996:47-60DNA倍體和S期比例-指導(dǎo)治療2 卵巢癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜癌，原發(fā)部位不明的癌癥 -早期 (I/II期)DNA倍體和DNA指數(shù)-預(yù)后長期和無病生存期2 卵巢癌-晚期 2. The Recommend Medicare National Coverage Po

18、licy for Flow Cytometry. HCFA Website,1999 62P53/Bcl-263P53乳腺癌 與病理學(xué)分級有關(guān), 并與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān) 大腸腫瘤 早期發(fā)現(xiàn)大腸癌胃 癌 與預(yù)后相關(guān)肝細胞癌 與組織分級, 腫瘤預(yù)后, 轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān)64Bcl-2Bcl-2在正常組織中的表達 造血系統(tǒng)細胞 淋巴, 單核細胞等 受激素或生長因子調(diào)節(jié)的腺上皮 前列腺上皮, 子宮內(nèi)膜等 干細胞或增值細胞 皮膚的基底細胞, 腸上皮 壽命長的分裂細胞 神經(jīng)元 胚胎組織Bcl-2在腫瘤組織中的表達 腎臟腫瘤 腎癌, 腎盂乳頭瘤, Wilms瘤, 腎嗜酸細胞瘤 前列腺癌 B細胞性

19、淋巴瘤 乳腺癌 (43%) 甲狀腺癌65nm23nm23與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān) 肝細胞癌 甲狀腺腫瘤 乳腺癌 結(jié)腸癌 肉瘤66CD44(CD44s/CD44v)67腫瘤多藥耐藥性(MDR)檢測P-gp在腫瘤組織中的表達 乳腺癌, 膀胱癌, 胃癌, 食管癌, 卵巢癌, 前列腺癌等 化療前高表達化療后高表達 腎細胞癌, 結(jié)腸癌, 肝癌,腎上腺皮質(zhì)癌, 胰腺癌等 化療前低表達 非何杰金氏淋巴瘤, 成神經(jīng)細胞瘤, 急性髓白血病等 化療不敏感化療敏感化療不敏感68乳腺癌石蠟切片脫臘ER(雌激素受體)ER抗體染色酶解流式檢測固定(多聚甲醛)破膜(70%甲醇)細 胞 69Cyclin(細胞周期蛋白)70細 胞 凋 亡71細胞凋亡分析 72DNA斷裂73乳腺癌Fas/FasL與疾病慢性病毒性肝炎惡性腫瘤細胞-黑色素瘤、結(jié)腸癌、肺癌、肝癌等腦缺血后細胞凋亡自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡Fas/FasL(CD95/CD95L)74乳腺癌Caspases早期細胞凋亡Annexin V/PI75移植免疫76CD25高于正常值5-10%, 表明即將或已發(fā)生排斥CD4/CD8比值下降提示并發(fā)兇險感染 0.2時, 必須停用免疫抑制劑CD2+HLA-DR+增加5-10%, 且不