微生物指標及微生物檢驗

1、微生物指標及微生物檢驗我國舊的飲用水水質標準是1985年頒布實施的GB5749-85，標準檢驗方法為GB5750-85。該標準與國外的飲用水標準相比，主要差別在于微生物指標項目少，缺少有機物和消毒副產物指標。微生物指標只有細菌總數(shù)和總大腸菌群2項，不能確切的評價水質的衛(wèi)生狀況。修訂后的標準，微生物學指標增加為6項：菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌、賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲。同時在資料性附件中增加了腸球菌和產氣莢膜梭狀芽胞桿菌。水質常規(guī)指標及限值修訂前修訂后微生物指標限值微生物指標限值細菌總數(shù)100 CFU/mL菌落總數(shù)/（CFU/mL）100總大腸菌群每100mL水樣中不得檢出總大

2、腸菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出糞大腸菌群每100mL水樣中不得檢出耐熱大腸菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出游離余氯在與水接觸30min后應不低于0.3mg/L,管梢末水不應低于0.5mg/L大腸埃希氏菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出水質非常規(guī)指標及限值修訂前修訂后微生物指標限值微生物指標限值-菌落總數(shù)/（CFU/100mL）500小型集中式供水和分散式供水部分水質指標及限值修訂前修訂后微生物指標限值微生物指標限值-賈第鞭毛蟲/（個/10L）1-隱孢子蟲/（個/10L）1生活飲用水水質參考指標及限值修訂前修訂后微生物指標限值微

3、生物指標限值-腸球菌/（CFU/100mL）0-產氣莢膜梭狀芽胞桿/（CFU/100mL）0一、菌落總數(shù)修訂前修訂后細菌總數(shù)原理：細菌總數(shù)是指水樣在一定條件下培養(yǎng)后（培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、需氧性質等）所得1ml水樣所含菌落的總數(shù)。按本規(guī)范規(guī)定所得結果只包括一群能在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫的需氧的細菌菌落總數(shù)培養(yǎng)條件：361 24h 菌落總數(shù)定義：水樣在營養(yǎng)瓊脂上有氧條件下37培養(yǎng)48h后，所得1ml水樣所含菌落的總數(shù)。361 48h 二、總大腸菌群（埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬）除多管發(fā)酵法、濾膜法外，增加了酶底物檢測方法多管發(fā)酵法修訂前修訂后多管發(fā)酵法原理：總大

4、腸菌群系指一群在37 培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，具有指示菌的一般特征，故以此作為糞便污染指標評價飲水的衛(wèi)生質量?？偞竽c菌群定義：總大腸菌群指一群在37 培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。結果：5個10ml 管中陽性管數(shù)為0時，MPN值為0（主要針對出廠自來水或需每天檢驗一次的水樣） 結果：5個10ml 管中陽性管數(shù)為0時，MPN值2.2 濾膜法修訂前修訂后濾膜法原理：用孔徑為0.45m的微孔濾膜過濾水樣,細菌被截留在濾膜上,將濾膜貼在選擇培養(yǎng)上,經培養(yǎng)后,計數(shù)生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落

5、數(shù)。培養(yǎng)條件：37 18-24h 濾膜法定義：總大腸菌群濾膜法是指用孔徑為0.45m的微孔濾膜過濾水樣, 將濾膜貼在添加乳糖的選擇培養(yǎng)上, 37 培養(yǎng)24h，能形成特征菌落的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌以檢測水中總大腸菌群的方法。培養(yǎng)條件：37 242h 酶底物法酶底物法定義：總大腸菌群酶底物法是指在選擇性培養(yǎng)基上能產生-半乳糖苷酶的細菌群組，該細菌群組能分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，以此技術來檢測水中總大腸菌群的方法。培養(yǎng)基：MMO-MUG培養(yǎng)基（Minimal Medium ONPG-MUG）。本方法可分為定性和定量。定量法：10管法、51孔定量法 培養(yǎng)條件： 36

6、1 24h 能產生-半乳糖苷酶的細菌群組分解ONPG使培養(yǎng)基呈黃色酶底物法的主要特點：優(yōu)點：可同時判斷水樣中大腸菌群和大腸埃希氏菌檢測時間較短，只需18-24h，最長需要28h無需確證試驗操作簡單，對試驗條件和人員要求低缺點：檢測成本高總大腸菌群三種方法的比較多管發(fā)酵法濾膜法酶底物法時間24-72h24-48h24-28h驗證試驗需要需要不需要步驟較繁較簡便簡便特殊設備顯微鏡顯微鏡、過濾設備壓膜機價格低低較高三、耐熱大腸菌群（埃希氏菌屬、耐熱克雷伯氏菌）檢測方法：多管發(fā)酵法、濾膜法修訂前修訂后原理：用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中大腸菌群區(qū)分開，在44.5仍能生長的大腸菌群,

7、稱為糞大腸菌群。 定義：用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中大腸菌群區(qū)分開，在44.5仍能生長的大腸菌群,稱為耐熱大腸菌群。 四、大腸埃希氏菌檢測方法：多管發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法大腸埃希氏菌多管發(fā)酵法定義：大腸埃希氏菌是指多管發(fā)酵法總大腸菌群陽性，在含有熒光底物的培養(yǎng)基上44.5培養(yǎng)24h產生-葡萄糖酫酸酶，分解熒光底物釋放出熒光產物，使培養(yǎng)基在紫外光下產生特征性熒光的細菌，以此來檢測水中大腸埃希氏菌的方法。培養(yǎng)基：EC-MUG（4-甲基傘形酮-D-葡萄糖酫酸苷）。培養(yǎng)條件：44.50.5 培養(yǎng)242h。紫外燈：波長366nm，功率6W大腸桿菌能產生-葡萄糖酫酸酶分解MUG，菌

8、落在366nm紫外光下產生藍色熒光濾膜法定義：用濾膜法檢測水樣后，將總大腸菌群陽性的濾膜 在含有熒光底物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能產生-葡萄糖酫酸酶分解熒光底物釋放出熒光產物，使菌落能夠在紫外光下產生特征性熒光，以此來檢測水中大腸埃希氏菌的方法。培養(yǎng)基：NA-MUG培養(yǎng)條件：361 培養(yǎng)4h紫外燈：波長366nm，功率6W酶底物法定義：在選擇培養(yǎng)基上能產生-半乳糖苷酶分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，并能產生-葡萄糖酫酸酶分解熒光底物釋放出熒光產物，使菌落能夠在紫外光下產生特征性熒光，以此技術來檢測大腸埃希氏菌的方法為大腸埃希氏菌酶底物法。培養(yǎng)基：ONPG-MUG結果判定：水樣變黃色同時在

9、366nm的紫外光下產生藍色熒光為陽性。水樣未變黃色而有藍色熒光產生不能判定為陽性。五、賈第鞭毛蟲子和隱孢子蟲 賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲是一類寄生于人和動物體內的腸道原蟲，可致人獸共患病?；即瞬〉娜撕蛣游飶募S便中排出大量的卵(孢)囊污染環(huán)境，在地面水和防護差的地下水及處理不良的自來水中都可檢出卵(孢)囊。隨著社會發(fā)展，優(yōu)質供水勢在必行。對一些潛在的危險因素加以限制很有必要。在此基礎上，新標準中增加了賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的檢測方法。Cryptosporidium 隱孢子蟲特點:單一細胞原生動物，約3-7m 。有微小隱孢子蟲、 鼠隱孢子蟲和貝氏隱孢子蟲三種，寄生于人、牛等體內的主要為微小隱孢子蟲（Cp

10、arvum）。宿主：人類、鳥類、鼠類、爬行類、魚類感染源:隱孢子蟲主要寄生在被感染的動物體腸道內，卵囊通過糞便排出體外污染環(huán)境。易感人群：免疫缺陷者（如愛滋患者）、兒童、老人、醫(yī)務人員等傳播方式:以糞-口，手-口途徑為主，污染的水源和空氣均可傳播。Cryptosporidium 隱孢子蟲生活周期子孢子滋養(yǎng)體型裂殖體裂殖子型裂殖體雌、雄配子體合子成熟卵囊裂殖子Cryptosporidium 隱孢子蟲(染色后熒光顯微鏡下)特點:單一細胞原生動物，大小約10-15m，含4對鞭毛和雙核。人、動物共染。寄生人體內為藍氏賈第鞭毛蟲 Giardia lamblia。在不同溫度和緯度地區(qū)均能發(fā)現(xiàn)該??；發(fā)達國家

11、感染率為2-5%；發(fā)展中國家感染率可高達到20-30%。 可引起急慢性腹瀉、腸吸收紊亂及延緩兒童的生長發(fā)育。傳染源：被孢囊污染的水和食物；往往一人帶孢囊全家感染；傳播:通過被污染的水和食物經口傳播；接觸（往往一人帶孢囊全家感染）；娛樂用水；旅游。易感人群：3歲以內嬰兒；免疫功能受損害者；旅游者。Giardia 賈第鞭毛蟲重要的動物宿主賈第鞭毛蟲在自然界廣泛存在，包括兩棲動物；鳥類；哺乳動物在內的40多種動物均可成為賈第鞭毛蟲的宿主。調查表明，人排出孢囊可使狗、海貍、麝鼠、沙土鼠及大鼠等動物感染。一些生活在水中的動物可被來源于人的賈第鞭毛蟲孢囊感染，因此這些動物即使不是主要宿主也可能作為賈第鞭蟲

12、的傳播媒介。Giardia 賈第鞭毛蟲兩蟲感染的特點賈第氏鞭毛蟲(Giardia)/隱孢子蟲(Cryptosporidium) / 感染后無特殊臨床癥狀,無預防疫苗，絕大多數(shù)抗生素無效，治療依賴于自身抵抗力大部份作為源水的江河及水庫水等地表水是高危的,大部分地下水都有被地表水污染的潛在危險可以通過被污染的源水而進入供水系統(tǒng),水源性感染已成為最大的感染源，但孢/卵囊對傳統(tǒng)的水處理法中氯化消毒有抗性,氯不能滲透過卵囊，沙濾及膜過濾法也不能完全去除 飲用水高溫煮沸也并非有效對氯消毒耐受、對熱敏感、感染劑量低、感染率高隱孢子蟲感染案例 1993 年在美國威斯康星州的東南 部港口城市密爾沃基暴發(fā) 400

13、,000 人被Cryptosporidium感染，4,000人到醫(yī)院 就醫(yī)，60人死亡。調查顯示致病源為處理不慎的飲用水。 1996 年美國CDC將 Cryptosporidium感染列入國家必須申報的傳染病名單，2002年將 Giardia 感染列入國家必須申報的傳染病名單 兩蟲的檢測方法（免疫磁分離熒光抗體法）檢測程序：水樣過濾 洗滌 離心 免疫磁珠捕獲卵囊 磁珠與卵囊復合物的分離 熒光標記和DAPI染色 顯微鏡檢查記述 結果報告檢測問題：方法操作復雜檢出率低無法進行生物活性判定不能進行屬、種鑒定價格高IDEXX Filta-Max 手動/自動系統(tǒng)濾器及濾芯FiltaMax Xpress

14、快速系統(tǒng)-濾器及濾芯過濾器濾芯Filta-Max : 濾芯結構（手動/自動法）60 層環(huán)狀海綿: 55mm x 10mm (18mm 中孔)從60cm 壓縮成 3cm螺栓固定Filta-Max xpress:快速法濾芯結構40 層海綿: 55mm x 10mm (18mm 中孔)39層海綿: 40mm x 10mm (18mm中孔)交互疊放從79cm 壓縮到 3cm螺栓固定水樣流向1.水樣過濾水樣從兩側流經壓縮的海綿膜匯集至中孔“兩蟲”在濾芯表面被捕獲濾器連接套件濾器濾芯（過濾模塊） 洗滌管濾芯置于洗滌管,并將濾芯下部的壓縮固定鑼栓解除周律性地壓縮/擴展海綿濾芯2.洗滌(淘洗)濾芯洗滌(淘洗)

15、裝置Filta-Max手動淘洗裝置Filta-Max自動淘洗裝置FiltaMax Xpress 快速淘洗裝置過濾器500ml錐形離心瓶Filta-Max xpress快速法淘洗流程 濾器（帶濾芯）放入淘洗裝置淘洗裝置連接緩沖液及空氣壓縮機加 4.0 巴(58 psi)壓縮空氣按動F1鈕2分鐘后收集400ml淘洗液快速全自動壓縮空氣濾器濾芯淘洗液收集1.將裝有淘洗液樣本的500mL離心管置2000g離心力下，離心15min。慢慢地減速，（不能使用制動裝置?。┮悦鈹嚻鸪恋砦?。 2.用吸氣裝置將沉淀物上層8-10mL處的懸浮物小心吸出 （吸氣裝置的真空應小于3.3kPa）。 3.離心濃縮4.免疫磁珠

16、捕獲捕獲原理: 標記A抗體的磁珠具有A抗原的C/G DYNAL MIX 1混合器MPC-1磁極MPC-S磁極5.免疫磁珠與孢（卵）囊復合物的分離60min5min10min染色鏡檢6.染色及鏡檢單克隆免疫熒光染色（FA-異硫氰酸熒光素）或 DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色熒光顯微鏡（Differential Interference Contrast, DIC） 隱孢子蟲賈第鞭毛蟲兩蟲的單抗染色結果隱孢子蟲的單克隆抗體染色結果 隱孢子蟲 DAPI 染色結果賈第鞭毛蟲的單克隆抗體染色結果賈第鞭毛蟲 DAPI 染色結果賈第鞭毛蟲孢囊和隱孢子蟲卵囊在熒光鏡下的特征1.在鏡下可見蘋果綠色的孢（卵）囊。2.孢（卵）囊的形狀、大小符合描述。3.膜與胞質的對照，膜的熒光要強一些。4.孢（卵）壁的完整性（孢囊可能會失去?。?.結果的計算、報告和檢測限每升水中的孢（卵）囊數(shù)計算公式：Y=（XV）/（V1V2）Y:每升水中的孢囊或卵囊的數(shù)目X：計數(shù)樣本的體積中孢囊或卵囊的數(shù)目V：離心后再