生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法微生物指標(biāo)

1、生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法微生物指標(biāo)菌落總數(shù)平皿計數(shù)法范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用平皿計數(shù)法測定生活飲用水及其水源水中的菌落總數(shù)。本法適用于生活飲用水及其水源水中菌落總數(shù)的測定術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。1.1.2.1standard plate-count bacteria水樣在營養(yǎng)瓊脂上有氧條件下37培養(yǎng)48h 后，所得1mL水樣所含菌落的總數(shù)培養(yǎng)基與試劑營養(yǎng)瓊脂成分： TOC o 1-5 h z A蛋白胨10gB牛肉膏3 gC氯化鈉5gD瓊脂10g20gE蒸餾水1000mL制法：將上述成分混合后，加熱溶解，調(diào)整pH為 7.4 7.6，分裝于玻璃容器中（如用含雜質(zhì)較多的瓊脂時，應(yīng)先過濾），

2、經(jīng)103.43kPa（ 121，151b）滅菌20min，儲存于冷暗處備用。儀器高壓蒸汽滅菌器。千熱滅菌箱。培養(yǎng)箱361。電爐。天平。冰箱。放大鏡或菌落計數(shù)器。pH 計或精密pH試紙。滅菌試管、平皿（直徑9cm） 、刻度吸管、采樣瓶等。檢驗步驟1.5.1 生活飲用水。以無菌操作方法用滅菌吸管吸取1mL充分混勻的水樣，注入滅菌平皿中，傾注約 15mL已融化并冷卻到45左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。每次檢驗時應(yīng)做一平行接種同時另用一個平皿只傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為空白對照。待冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面向上，置于36 ?培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，進行菌落計數(shù)，即為水樣1mL

3、中的菌落總數(shù)。1.1.5.2 水源水1.5.2.1以無菌操作方法吸取1mL充分混勻的水樣，注入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1:10稀釋液1.5.2.2吸取1:10的稀釋液1mL注人盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1:100稀釋液。按同法依次稀釋成1:1000， 1:10000稀釋液等備用。如此遞增稀釋一次，必須更換一支1mL滅菌吸管。.2.3用滅菌吸管取未稀釋的水樣和2個 3個適宜稀釋度的水樣1mL，分別注入滅菌平皿內(nèi)。以下操作同生活飲用水的檢驗步驟。. 菌落計數(shù)及報告方法作平皿菌落計數(shù)時，可用眼睛直接觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落數(shù)后，應(yīng)求出同稀釋度的

4、平均菌落數(shù)，供下一步計算時應(yīng)用。在求同稀釋度的平均數(shù)時，若其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半皿計數(shù)后乘2 以代表全皿菌落數(shù)。然后再求該稀釋度的平均菌落數(shù)不同稀釋度的選擇及報告方法首先選擇平均菌落數(shù)在30300之間者進行計算，若只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合 TOC o 1-5 h z 此范圍時，則將該菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1 中實例1） 。若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30300之間，則視二者之比值來決定，若其比值小于 2 應(yīng)報告兩者的平均數(shù)（如表 1

5、 中實例2） 。 若大于 2 則報告其中稀釋度較小的菌落總數(shù)（如表 1 中實例3） 。若等于2 亦報告其中稀釋度較小的菌落數(shù)（見表1 中實例4） 。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300， 則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1 中實例5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)以按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1 中實例6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間， 則應(yīng)以最接近30 或 300 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1 中實例7）若所有稀釋度的平板上均無菌落生長，則以未檢出報告之如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可計”報告，而應(yīng)在稀釋度最

6、大的平板上，任意數(shù)其中2個平板1cm2中的菌落數(shù)，除 2求出每平方厘米內(nèi)平均菌落數(shù)，乘以皿底面積63.6cm2，再乘其稀釋倍數(shù)作報告菌落計數(shù)的報告：菌落數(shù)在100 以內(nèi)時按實有數(shù)報告，大于 100時， 采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五人方法計算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用10 的指數(shù)來表示（見表1“報告方式”欄）。表 1 稀釋度選擇及菌落總數(shù)報告方式實例不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個稀釋度 菌落數(shù)之比菌落總數(shù)/（ CFU/mL ）報告方式/（ CFU/mL ）10-110-210-311 3651642016 400416 000或 1.6 10422 760295461.6

7、37 75038 000或 3.8 10432 890271602.227 100427 000或 2.7 10415030821 50041 500或 1.5 105多不可計1 650513513 000451 0000或 5.1 10627115270270或 2.7 1047多不可計3051230 50031 000或 3.1 1042 總大腸菌群2.2 濾膜法范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用濾膜法測定生活飲用水及其水源水中的總大腸菌群 本法適用于生活飲用水及其水源水中總大腸菌群的測定術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)2.2.2.1總大腸菌群濾膜法membrane filter technique

8、 for total coliforms總大腸菌群濾膜法是指用孔徑為0.45pm的微孔濾膜過濾水樣，將濾膜貼在添加乳糖的選擇性培養(yǎng)基上37培養(yǎng)24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌以檢測水中總大腸菌群的方法。培養(yǎng)基與試劑品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基成分 TOC o 1-5 h z A蛋白胨10gB 酵母浸膏5gC 牛肉膏5gD 乳糖10gE 瓊脂15g20gF 磷酸氫二鉀3.5gG 無水亞硫酸鈉5gH 堿性品紅乙醇溶液（50g/L ）20mLI 蒸餾水1000mL儲備培養(yǎng)基的制備先將瓊脂加到500mL蒸餾水中，煮沸溶解，于另500mL蒸餾水中加入磷酸氫二鉀、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉

9、膏，加熱溶解，倒人已溶解的瓊脂，補足蒸餾水至1000mL， 混勻后調(diào)pH為 7.27.4 ，再加人乳糖，分裝，68.95kPa（ 115，10b）高壓滅菌20min，儲存于冷暗處備用。本培養(yǎng)基也可不加瓊脂，制成液體培養(yǎng)基，使用時加2mL 3mL于滅菌吸收墊上，再將濾膜置于培養(yǎng)墊上培養(yǎng)。平皿培養(yǎng)基的配制將上法制備的儲備培養(yǎng)基加熱融化，用滅菌吸管按比例吸取一定量的50g/L 的堿性品紅乙醇溶液置于滅菌空試管中，再按比例稱取所需的無水亞硫酸鈉置于另一滅菌試管中，加滅菌水少許，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min 以滅菌。用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色退成淡粉色為止

10、，將此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加到已融化的儲備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡），立即將此種培養(yǎng)基15mL傾入已滅菌的空平皿內(nèi)。待冷卻凝固后置冰箱內(nèi)備用。此種已制成的培養(yǎng)基于冰箱內(nèi)保存不宜超過兩周。如培養(yǎng)基已由淡粉色變成深紅色，則不能再用。乳糖蛋白陳培養(yǎng)液同 2.1.3.1儀器濾器濾膜，孔徑0.45 m抽濾設(shè)備。無齒鑷子。其他儀器同多管發(fā)酵法2.1.4 。檢驗步驟準(zhǔn)備工作濾膜滅菌：將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次， 每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2 次 3次，以除去殘留溶劑。濾器滅菌：用點燃的酒精棉球火焰滅菌。也可用蒸汽滅菌器103.43kPa（ 121

11、，15b）高滅菌 20min.過濾水樣用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100mL水樣（如水樣含菌數(shù)較多，可減少過濾水樣量，或?qū)⑺畼酉♂專┳⑷霝V器中，打開濾器閥門，在-5.07 104 Pa（負0.5 大氣壓）下抽濾。培養(yǎng)水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h 2h結(jié)果觀察與報告挑取符合下列特征菌落進行革蘭氏染色、鏡檢：紫紅色、具有金屬光澤的菌落；深紅色、不帶或略帶金屬光澤的

12、菌落； 淡紅色、中心色較深的菌落。凡革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，于 37培養(yǎng)24h， 有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則判定為總大腸菌群陽性。按式（ 1）計算濾膜上生長的總大腸菌群數(shù)，以每100mL水樣中的總大腸菌群數(shù)（ CFU/100m）報告之。L總 大 腸 菌群 菌落 數(shù)CFU/100mL ）數(shù)出的總大腸菌群菌落過濾的水樣體積（總 大 腸 菌群 菌落 數(shù)CFU/100mL ）數(shù)出的總大腸菌群菌落過濾的水樣體積（數(shù) 100 （ mL）1）3.2 濾膜法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用濾膜法測定生活飲用水及低濁度水源水中的耐熱大腸菌群。本法適用于生活飲用水及低濁度水源水中耐熱大腸菌群的測定。術(shù)語和定

13、義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。耐熱大腸菌群濾膜法membrane filter technique for thermotolerant coliform bacteria耐熱大腸菌群濾膜法是指用孔徑為0.45m 的濾膜過濾水樣，細菌被阻留在膜上，將濾膜貼在添加乳糖的選擇性培養(yǎng)基上，44.5 培養(yǎng) 24h 能形成特征性菌落以此來檢測水中耐熱大腸菌群的方法。培養(yǎng)基與試劑MFC 培養(yǎng)基成分 TOC o 1-5 h z A 胰胨10gB 多胨5gC 酵母浸膏3gD 氯化鈉5gE 乳糖12.5gF 3 號膽鹽或混合膽鹽1.5gG 瓊脂15gH 苯胺藍0.2gI蒸餾水1000mL制法在 1000mL蒸餾

14、水中先加入玫紅酸（ 10g/L） 的 0.2mol/L 氫氧化鈉溶液10mL， 混勻后，取 500mL加入瓊脂煮沸溶解，于另外500mL蒸餾水中，加人除苯胺藍以外的其他試劑，加熱溶解，倒入已溶解的瓊脂，混勻調(diào)pH為 7.4， 加入苯胺藍煮沸，迅速離開熱源，待冷卻至60左右，制成平板，不可高壓滅菌。制好的培養(yǎng)基應(yīng)存放于2 10，不超過96h。本培養(yǎng)基也可不加瓊脂，制成液體培養(yǎng)基使用時加2mL3mL于滅菌吸收墊上，再將濾膜置于培養(yǎng)墊上培養(yǎng)。EC 培養(yǎng)基同 3.1.3.1 。儀器隔水式恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水浴。玻璃或塑料培養(yǎng)皿：60mm 5mm或50mm 12mm。 TOC o 1-5 h z 其他儀器同2.2.4檢驗步驟準(zhǔn)備工作同2.2.5.1。過濾水樣同2.2.5.2。培養(yǎng)：水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在 MFC培養(yǎng)基上，濾膜截留細菌面向上濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入4.5 隔水式培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h 士 2h，如使用恒溫水浴，則需用塑料平皿，將皿蓋緊，或用防水膠帶