Omentin-1對巨噬細胞ABCA1介導膽固醇流出及抗動脈粥樣硬化的作用及機制

1、Omentin-1 對巨噬細胞 ABCA1介導膽固醇流出及抗動脈粥樣硬化的作用及機制動脈粥樣硬化 (Atherosclerosis,As)在全球的罹患率以及致死率都名居前列 , 嚴重危害人類的健康。 在動脈粥樣硬化早期 , 其標志性病理特征是血管內(nèi)皮下大量的巨噬細胞內(nèi)脂質蓄積以及泡沫細胞的形成。泡沫細胞最終壞死崩解 , 釋放出細胞內(nèi)的膽固醇 , 是構成動脈粥樣硬化斑塊的最主要成分 , 促進動脈粥樣硬化的進一步進展。 因此 , 促進巨噬細胞內(nèi)膽固醇流出及體內(nèi)膽固醇逆向轉運 (reverse cholesterol transport,RCT), 從而抑制泡沫細胞形成和血管壁內(nèi)脂質沉積 , 對動脈

2、粥樣硬化性的防治具有重要意義。三磷酸腺苷結合盒轉運體 A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)是一個膜整合蛋白 , 其以 ATP作為能源將胞內(nèi)游離的膽固醇及磷脂轉運至胞膜的外側面 , 最終與貼附在細胞表面的載脂蛋白AI(apoproteinAI,apoAI) 結合 , 從而形成新生的高密度脂蛋白(high densitylipoprotein,HDL)。這是 HDL生成所必需的過程 , 也是促進巨噬細胞內(nèi)過多的膽固醇外流以及rct的關鍵步驟。abca1 在巨噬細胞中的表達以及其活性往往受到轉錄及轉錄后水平的精細調(diào)控。網(wǎng)膜素 (omentin)

3、是一類新發(fā)現(xiàn)的脂肪細胞因子, 主要由網(wǎng)膜脂肪組織表達和釋放。值得注意的是 , 研究發(fā)現(xiàn)這種基因可調(diào)節(jié)葡萄糖攝取。肥胖或肥胖相關疾病患者 , 包括 2 型糖尿病、內(nèi)皮功能障礙、 頸動脈粥樣硬化和冠狀動脈疾病, 發(fā)現(xiàn)其血漿 omentin-1 水平降低了。研究證明 ,omentin-1與高密度脂蛋白膽固醇 (hdl-c)呈正相關 , 與葡萄糖和甘油三酸酯水平呈負相關。 代謝綜合征 (mets) 初期患者循環(huán) omentin-1 水平異常者其罹患糖尿病和心血管疾病的風險更高。因此 ,omentin-1與代謝綜合征密切相關, 在代謝綜合征患者的動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生重要作用。 omentin-1

4、在 rct 、脂質代謝和 as 中差異表達的發(fā)現(xiàn)為我們提供了新的途徑和視角。因此 ,omentin-1有望成為心血管保護因子和干預靶點之一。然而 ,omentin-1 在 abca1 表達及導致提高 hdl 功能和膽固醇逆向轉運中的作用研究尚少。本研究中 , 我們研究 omentin-1 對巨噬細胞 abca1 表達的作用和潛在的分子機制。為了探討 omentin-1 抗動脈粥樣硬化的相關作用機制 , 我們首先在第一部分實驗中觀察 omentin-1 對 thp-1 巨噬細胞 abca1 表達、胞內(nèi)膽固醇流出和脂質含量的影響。在第二部分實驗中我們探索了 omentin-1 介導 thp-1 巨

5、噬細胞 abca1 表達及膽固醇流出的作用機制。接著 , 我們在第三部分實驗中 , 觀察了 omentin-1 對apoe-/- 小鼠的血脂水平、膽固醇逆向轉運和動脈粥樣硬化病變的影響。最后 , 我們在第四部分實驗中 , 觀察了具有較強調(diào)脂作用的丹參酮iia(tanshinoneiia,tan)對巨噬細胞的 omentin-1 和 abca1 的表達、脂質代謝 ,以及對 apoe-/- 小鼠的動脈粥樣硬化病變的影響, 研究 tan 通過上調(diào) omentin-1發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用機制。 本研究揭示了 omentin-1 抗動脈粥樣硬化的作用以及機制 , 也許為動脈粥樣硬化性疾病提供新的防治

6、靶點。第 1 章 omentin-1 對 thp-1 巨噬細胞 abca1 表達及膽固醇流出的影響目的 :觀察 omentin-1 對 thp-1 巨噬細胞 abca1mrna 及蛋白表達水平、胞內(nèi)膽固醇流出和脂質含量的影響。方法: 用 omentin-1 和 / 或 lxr sirna處理 thp-1 源性巨噬細胞后 , 用 rt-pcr方法檢測各個實驗組細胞的abca1mrna 的表達 ,westernblot檢測 abca1 蛋白水平 ,hplc檢測胞內(nèi)總膽固醇 (tc) 游離膽固醇 (fc) 及膽固醇酯(ce) 含量 , 液體閃爍計數(shù)儀檢測胞內(nèi)膽固醇流出, 油紅 o 染色觀察胞內(nèi)脂滴情

7、況。結果 :omentin-1呈時間和濃度依賴性上調(diào)巨噬細胞abca1 的表達 , 促進胞內(nèi)膽固醇流出 , 降低胞內(nèi) tc 、fc 和 ce 含量 , 抑制胞內(nèi)脂質蓄積和泡沫細胞形成。而abca1sirna 與 omentin-1 共處理細胞后 , 明顯抑制 omentin-1 促膽固醇流出的作用 , 胞內(nèi)脂質蓄積和泡沫細胞形成明顯加劇。結論 :(1)omentin-1增加 thp-1 巨噬細胞 abca1mrna和蛋白表達。(2)omentin-1促進 abca1 介導的 thp-1 巨噬細胞脂質流出 , 抑制巨噬細胞內(nèi)脂質蓄積和泡沫細胞形成。第 2 章 omentin-1 介導 thp-1

8、 巨噬細胞 abca1 表達及膽固醇流出的作用機制目的 : 探索 omentin-1 介導 thp-1 巨噬細胞 abca1 表達及膽固醇流出的作用機制。方法 : 分別用 omentin-1 或和 lxr sirna 、pi3ksirna 、aktsirna 、 pi3k 抑制劑ly2940029 及 akt 抑制劑 himo 處理 thp-1 源性巨噬細胞 24h 后,westernblot檢測 abca1lxr 蛋白水平 ,hplc檢測胞內(nèi)總膽固醇 (tc) 游離膽固醇 (fc) 及膽固醇酯 (ce) 含量 , 液體閃爍計數(shù)儀檢測胞內(nèi)膽固醇流出, 油紅 o 染色觀察胞內(nèi)脂滴情況。結果 :o

9、mentin-1上調(diào)巨噬細胞abca1 的表達 , 促進胞內(nèi)膽固醇流出 , 降低胞內(nèi) tc 、fc 和 ce 含量 , 抑制胞內(nèi)脂質蓄積和泡沫細胞形成。 而分別加用 lxr sirna 、pi3ksirna、aktsirna、pi3k 抑制劑 ly2940029 及 akt 抑制劑 himo 與 omentin-1共處理細胞后 , 明顯抑制 abca1 的表達及其促膽固醇流出的作用, 胞內(nèi)脂質蓄積和泡沫細胞形成明顯加劇。結論 :(1)omentin-1通過 pi3k/akt途徑增加人 thp-1 巨噬細胞 lxr 和abca1 表達 , 促進脂質流出 , 抑制巨噬細胞內(nèi)脂質蓄積和泡沫細胞形成。

10、第3 章omentin-1 對 apoe-/- 小鼠動脈粥樣硬化的影響目的: 探討 omentin-1 對 apoe-/-小鼠體內(nèi) rct 、血脂水平、主動脈壁的脂質沉積, 以及對粥樣硬化病變的影響和機制。方法 : 采用高脂飲食 ( 含 15%豬油 +0.25%膽固醇 ) 喂飼的 45 只 apoe-/- 小鼠 ,并隨機地分為三組 , 分別為 : 高脂對照組、 omentin-1 組、 omentin-1+ly2940029組。 omentin-1 組腺病毒轉染 omentin-1 以 1108pfu/kg(pfu:空斑形成單位 ),ome+ly 組小鼠再加以 20mg/kgpi3k 抑制劑

11、ly2940029, 溶入 0.2ml 的生理鹽水中進行尾靜脈注射 , 每 2 周注射一次 , 都用基礎飲食加上高脂高膽固醇 (15%豬油 +0.25%膽固醇 ) 喂養(yǎng) , 直至實驗結束 , 共處理 8 周。采用液體閃爍計數(shù)以測定mpm來源的 rct效率 ; 采用酶氧化法檢測甘油三酯(tg) 、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)及低密度脂蛋白膽固醇 (ldl-c)等血脂水平 ; 采用蘇丹染色以顯示主動脈內(nèi)膜的as 病變情況 ; 采用 he 染色顯示主動脈竇的 as 病變情況 ; 采用油紅 o 染色以觀察主動脈竇處脂質沉積的情況; 采用 masson三色染色以顯示斑塊中的膠原纖維 ; 采

12、用 westernblot 檢測小鼠的主動脈 abca1 等蛋白的表達。結果 : 輸注了轉染 omentin-1 的質粒明顯增強了 apoe-/-小鼠糞便中 3h 固醇的放射活性 , 并增高血漿的 hdl-c水平 , 降低了 ldl-c水平 ,使主動脈內(nèi)膜的 as 病變面積減小 , 減少主動脈竇處的脂質沉積, 增強 as 斑塊的穩(wěn)定性 , 增加了主動脈 abca1 的蛋白表達。注射 ly2940029 則明顯減少糞便中的固醇水平, 增加主動脈壁內(nèi)脂質沉積,促進動脈粥樣硬化病變的發(fā)展, 下調(diào) abca1 蛋白表達。結論 :(1)omentin-1促進apoe-/- 鼠體內(nèi) rct和升高血漿 hd

13、l-c水平。(2)omentin-1抑制 apoe-/- 鼠主動脈脂質沉積 , 延緩粥樣硬化病變的進展。(3)omentin-1增強 apoe-/- 鼠主動脈壁組織的abca1 表達 , 并且其可能是通過pi3k/akt信號通路而起調(diào)節(jié)作用的。第 4 章丹參酮 iia 對巨噬細胞 omentin-1/abca1 水平及 apoe-/- 小鼠主動脈病變的影響及其機制目的: 觀察丹參酮 iia(tanshinoneiia,tan)對 thp-1 巨噬細胞中 omentin-1 和 abca1 表達 , 以及對 apoe-/- 小鼠體內(nèi)血脂水平、 rct 、主動脈壁 as 病變的影響 , 并探討 t

14、an 抗 as 的作用機制。方法 : 用 tan 處理 thp-1 巨噬細胞 , 并結合 omentin-1sirna 轉染 thp-1 巨噬細胞后 , 采用實時熒光定量 pcr 以檢測 omentin-1 和 abca1 水平 , 采用 westernblot檢測 omentin-1 和 abca1 蛋白表達 ; 采用液體閃爍計數(shù)以測定荷脂THP-1巨噬細胞內(nèi)的膽固醇流出情況, 采用HPLC檢測細胞內(nèi)脂質的含量。高脂飲食 ( 含 15%豬油 +0.25%膽固醇 ) 喂飼的 45 只 apoE-/- 小鼠被隨機分為三組 , 分別為 : 高脂對照組、丹參酮 IIA 組和丹參酮 IIA+Oment

15、in-1 siRNA 組。采用液體閃爍計數(shù)以測定 MPM來源的 RCT效率 , 采用酶氧化法以檢測 TG、TC、HDL-c和 LDL-c 等的血脂水平 , 采用蘇丹染色以顯示主動脈內(nèi)膜的As 病變情況 , 采用HE染色以顯示主動脈竇As 病變情況 , 采用油紅 O染色以顯示主動脈竇處脂質的沉積情況 , 采用 Masson三色染色以顯示As 斑塊中的膠原纖維情況。結果 : 觀察到 Tan 可以呈劑量和時間依賴性地增強了THP-1巨噬細胞中Omentin-1 和 ABCA1蛋白的表達 , 增強細胞內(nèi)膽固醇流出 , 并減少細胞內(nèi)的FC、CE和 TC含量。 Tan 可增強 apoE-/- 小鼠糞便中 3H膽固醇的放射活性 , 并增高血漿HDL-c 水平 , 降低 LD