免疫組化的基本原理和相關(guān)技術(shù)問題課件

1、免 疫 組 織 化 學(xué)Immunohistochemistry (IHC)馮振卿 MD Ph.DDepartment of PathologyKey Lab. Of Antibody Technique, Ministry of HealthTel:86862739(L) 86863100(O)e-mail:免疫組織化學(xué) 劉彥仿 主編 人民衛(wèi)生出版社免疫細(xì)胞化學(xué)與核酸雜交技術(shù) 蔡文琴 王伯云 主編 四川科技出版社免疫組織化學(xué)新編紀(jì)小龍主編人民軍醫(yī)出版社第一章 免疫組織化學(xué)基本原理及相關(guān)知識 蛋白質(zhì) 磷脂多肽 多糖核酸 受體酶 病原體激素免疫組織化學(xué)技術(shù)的突出優(yōu)點： 高度的特異性 敏感性高 方法

2、步驟統(tǒng)一 機(jī)能和代謝密切結(jié)合， 定性、定位、定量的統(tǒng)一 免疫組織化學(xué)技術(shù)在細(xì)胞、染色體或亞細(xì)胞水平原位檢測抗原分子，是其它任何生物技術(shù)難以達(dá)到和代替的。它能在細(xì)胞、基因和分子水平同時原位顯示基因及其表達(dá)產(chǎn)物，形成了新的檢測系統(tǒng)，為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和各個領(lǐng)域分子水平的研究與診斷，開拓了廣闊的前景。核酸分子探針-雜交-免疫組織化學(xué)放大和顯示雜交信號雜交免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)的全過程：抗原的提取和純化免疫動物或細(xì)胞融合（單克隆抗體）抗體效價檢測和提取、純化標(biāo)記抗體細(xì)胞、組織切片標(biāo)本的制備免疫組織化學(xué)反應(yīng)和顯色觀察和記錄結(jié)果技術(shù)問題的重要性第一節(jié) 有關(guān)的細(xì)胞和組織學(xué)技術(shù)一、取材（一）細(xì)胞標(biāo)本的取材 印片

3、法 穿刺吸取涂片法 體液沉淀涂片法 細(xì)胞數(shù)量多：直接涂片 細(xì)胞數(shù)量少：離心沉淀涂片 培養(yǎng)細(xì)胞 直接收集 培養(yǎng)液離心涂片（二）組織標(biāo)本的取材 活檢鉗的刀口必須鋒利，以免組織受擠壓 取材部位必須是主要病變區(qū) 必須取病灶與正常組織交界處 必要時取遠(yuǎn)離病灶區(qū)的正常組織作對照二、固定固定劑：常用醛類固定劑 10%福爾馬林（甲醛10ml + 蒸餾水90ml） 10%中性緩沖福爾馬林（甲醛10ml + 0.01mol/L pH7.4 PBS 90ml ） 2.5%戊二醛 用于電鏡 丙酮 用于冰凍切片、細(xì)胞涂片 4固定方法： 浸入法 灌注法四. 玻片處理和涂膠 載玻片和蓋玻片處理 蓋玻片、載玻片 清潔液中浸泡

4、24h（硫酸 + 重鉻酸鉀）清水沖洗蒸餾水沖洗95%酒精浸泡24h烘干 載玻片涂粘附劑: APES 多聚賴氨酸一、抗體 新制備或購進(jìn)的是原液或凍干品，抗血清為全血清，單克隆抗體是培養(yǎng)上清或腹水。 1. 抗體貯存 2. 抗體稀釋 按不同的免疫染色方法和抗原性強(qiáng)弱及抗原的多少，稀釋各種抗體原液，以便獲得最佳免疫染色效果。 抗體最佳稀釋度的測定方法 二抗 一 抗 1 1:50 1:100 1:200 1:400_ 1:50 + + + 1:100 + + + 1:200 + + 1:400 _3抗體的選擇 (1) 多抗：雖然存在交叉反應(yīng)的問題，但由于識別多個抗原表位，所以即使有少數(shù)幾個抗原表位被破壞

5、，仍然不會影響實驗結(jié)果，這是多抗的優(yōu)點之一。 (2) 單抗：識別單個抗原表位，所以特異性高。但如果所識別的抗原表位被破壞，則會影響實驗結(jié)果，這也是單抗的缺點之一。 多抗？單抗？抗原表位的豐富程度也可應(yīng)用多個單抗（a cocktail of monoclonal antibodies）解決抗原表位少的問題二、免疫染色 一般程序： 標(biāo)記抗體與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)結(jié)合 用PBS洗去未結(jié)合的部分 直接觀察結(jié)果（免疫熒光）或顯色后再用顯微鏡觀察（免疫酶） 1. 增強(qiáng)特異性染色的方法 蛋白酶消化法 胃蛋白酶、胰蛋白酶 合適的抗體稀釋度 第一抗體 溫育時間 37 30-60 min, 4 過夜 多層染色法（雙層、三層）2. 減少或消除非特異性染色的方法 加二抗動物的正常血清 2%5%牛血清白蛋白3. 顯色反應(yīng)的控制 顯色劑的濃度、溫育時間4. 復(fù)染三、對照 陽性對照 陰性對照 阻斷試驗 替代對照 空白對照 自身對照 吸收試驗四、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷 陽性細(xì)胞染色分布有三種類型：胞漿、胞核、細(xì)胞膜表面 陽性細(xì)胞分布可分為灶性或彌漫性 由于細(xì)胞內(nèi)抗原含量不同，所