酶促反應動力學實驗

1、文檔編碼 : CJ8D2A2I4R4 HP9S7E3J3H9 ZI4D1X1N7J9酶動力學綜合試驗 試驗（一）堿性磷酸酶 Km值的測定【目的要求】1.明白底物濃度對酶促反應速度的影響2.明白米氏方程、 Km 值的物理意義及雙倒數(shù)作圖求【試驗原理】Km 值的方法；1、堿性磷酸酶：堿性磷酸酶是廣泛分布于人體各臟器器官中,其中以肝臟為最多；其次為腎臟、骨骼、腸和胎盤等組織；但它不是單一的酶,而是一組同功酶；本試驗用的堿性磷酸酶是從大腸桿菌中提取的；2、米氏方程：Michaelis-Menten 在爭論底物濃度與酶促反應速度的定量關(guān)系時,應動力學的基本公式,即：錯誤！未找到引用源；導出了酶促反 1

2、式中： v 表示酶促反應速度,錯誤！未找到引用源； 表示酶促反應最大速度,S表示底物濃度,錯誤！未找到引用源； 表示米氏常數(shù)；3、錯誤！未找到引用源； 值的測定主要接受圖解法,有以下四種：雙曲線作圖法（圖 1-1,a）依據(jù)公式（ 1）,以 v 對s作圖,此時 1/2 錯誤！未找到引用源；時的底物濃度 s值即為 Km 值,以克分子濃度（ M）表示；這種方法實際上很少接受,由于在實驗條件下的底物濃度很難使酶達到飽和；實測 錯誤！未找到引用源； 一個近似值,因而 1/2 錯誤！未找到引用源； 不精確；此外由于 v 對S的關(guān)系呈雙曲線,試驗數(shù)據(jù)要求較多,且不易繪制； Lineweaver- Burk作

3、圖法雙倒數(shù)作圖法（圖 1-1,b）實際工作中,常將米氏方程（式（1）作數(shù)學變換,使之成為直線形式,測定要便利、精確得多； 其中之一即取 （1）式的倒數(shù), 變換為 Lineweaver- Burk方程式：錯誤！未找到引用源；2 以錯誤！未找到引用源； 對錯誤！未找到引用源； 作圖,即為 y=ax+b 形式；此時斜率為 錯誤！未找到引用源；,縱截距為 錯誤！未找到引用源；把直線外推與橫軸相交,其截距相交,其截距即為錯誤！未找到引用源； ；Hofstee 作圖法（略）把（ 2）式等號兩邊乘以 錯誤！未找到引用源； ,得：錯誤！未找到引用源；3 以 v 對錯誤！未找到引用源； 作圖,這時斜率為 錯誤！

4、未找到引用源； ,縱截距為錯誤！未找到引用源； ,橫截距為 錯誤！未找到引用源； ；Hanas作圖法（略）把（ 2）式等號兩邊乘以 S,得：錯誤！未找到引用源；4 以 對s作圖,這時斜率為 錯誤！未找到引用源； ,縱截距為 錯誤！未找到引用源；（a）b 本試驗主要以雙倒數(shù)法,即Lineweaver- Burk 作圖法來測定堿性磷酸酶Km 值；具體原理如下：本試驗以堿性磷酸酶為例, 用磷酸苯二鈉為其作用物, 堿性磷酸酶能分解磷酸苯二鈉產(chǎn)生酚和磷酸,在適宜條件下（PH10.0,和 60）,精確反應13 分鐘；在堿性條件下酚可與酚試劑生成藍色化合物,以波長 色澤深淺與光密度成正比；反應式如下：620

5、nm 比色；在確定條件下然后以光密度直接表示不同底物濃度時的酶反應速度,即以光密度的倒數(shù)作縱坐標,以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標,按 Lineweaver- Burk 作圖法來測定堿性磷酸酶Km值；【儀器與試劑】儀器：1. 恒溫水浴2. 721 型分光光度計試劑：1 酚試劑：稱鎢酸鈉（ 錯誤！未找到引用源；W 錯誤！未找到引用源； 2 錯誤！未找到引用源； O）100g,鉬酸鈉（ 錯誤！未找到引用源； Mo 錯誤！未 找到引用源； 2 錯誤！未找到引用源； O）25g 置 1500mL 磨口回流裝置內(nèi),加蒸餾水 700mL,85%磷酸 50mL 和濃硫酸 100mL；充分混勻,使其溶解；小 火加熱,

6、回流 10h（燒瓶內(nèi)加小玻璃珠數(shù)顆,以防溶液溢出）,再加入硫酸鋰（LiSO4）150g,蒸餾水 50mL 及液溴數(shù)滴；在通風櫥中開口煮沸 15min,以除去余外的溴；冷卻后定容至1000mL,過濾即成,此液應為鮮黃色,不帶任何綠色；置棕瓶中,可在冰箱長期儲存；如此貯存液使用過久,顏色由黃變 綠,可加幾滴液溴,煮沸幾分鐘,復原原色仍可連續(xù)使用；使用時用蒸餾水 稀釋一倍,最終酸度為 1N；2 2.5mM 磷酸苯二鈉基質(zhì)液：稱取625mg磷酸苯二鈉（ C6H5PO4Na2.2H2O）,溶于 1,000ml 容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,加數(shù)滴夜溴以防腐,置冰箱 內(nèi)可儲存一年之久；3 堿性緩沖液（ p

7、H10.0）： 稱取無水碳酸鈉 6.36g及碳酸氫鈉 3.36g,溶解于蒸 餾水中,并稀釋至 1,000ml. 4 堿性磷酸酶液：稱取堿性磷酸酶【試驗步驟】取 6 支試管按下表加入試劑：1mg,加水 34ml,冰箱內(nèi)可儲存五周左右；2.5mM 磷酸苯二1 2 3 4 5 6 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 鈉（ ml）0.8 0.6 0.4 0.2 - 0.1 蒸餾水（ ml）堿性緩沖液1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （ml）混勻后, 60欲溫 5 分鐘堿性磷酸酶液0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 - （ml）混勻后, 60水浴 13 分鐘（精確計時）留意

8、 ：1）加入堿性磷酸酶液要快速、精確；用移液槍加酚試劑（ ml）2）此時為酶促反應,總體積2.1ml 1.0 1.0 3）第六管不加酶；1.0 1.0 1.0 1.0 10%Na2CO3ml3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 混勻后,室溫放置 15 分鐘 留意 ：1）酚試劑為顯色劑,同時為酶的變性劑,故加入酚試劑后酶促反應即停止；2）Na2CO3 供應堿性環(huán)境,加入 以 6 管為調(diào)零點,在 620nm 波特長比色；【結(jié)果處理】1 將各管光密度和底物濃度記入下表Na2CO3 后試劑才顯色管號O.D 1/O.D S 1/S 1 2 3 4 5 2 以 1/O.D 為縱坐標, 1/s 為

9、橫坐標,按 Lineweaver- Burk作圖,求出堿性磷酸酶 的 Km 值；【留意事項】1） 加入堿性磷酸酶的量要精確 2） 保溫時間要精確精確保溫的方法：從第一管加入酶液開頭計時,每隔1 分鐘向下一只試管加酶液,直至加完,到精確 13 分鐘馬上向第一管加酚試劑,以終止其反應,并每隔 1分鐘向下一只試管加酚試劑 ,直至加完止,這樣保證每管精確保溫 13 分鐘；【摸索題】1） Km 的意義及其影響因子2） 為什么酶促反應速度以初速度表示3） 為什么 O.D 可直接代替 V 作圖4） 分析自己的試驗數(shù)據(jù)試驗（二）溫度對酶活性的影響【試驗目的】明白溫度對酶活性及酶促反應速度的影響,加深對酶特性的

10、熟識；【試驗原理】每種酶都有其最適溫度, 高于或低于此溫度酶的活性都降低；一般而言, 如酶處于過高的溫度環(huán)境中, 會使酶活性永久丟失； 而如處于極低溫度的環(huán)境中只會使酶活性受到抑制,一旦溫度適宜,酶又會全部或部分的復原其活性；【儀器與試劑】儀器：1冰箱2.恒溫水浴鍋3.試管和試管架4吸量管及吸量管架5.移液槍及槍頭6.膠頭滴管7燒杯試劑：1PH6.8 的緩沖液：量取 混合搖勻即可；15.45ml 的 0.2M 磷酸氫二鈉和 4.55ml 的檸檬酸20.5% 淀粉的 0.5% 氯化鈉溶液：0.5g 可溶性淀粉和 0.5g 氯化鈉,溶于 100ml 蒸餾水（需加熱）；3003175g/L 碘液41

11、M HCl 溶液5.1M NaOH 溶液6.稀釋 100 倍的唾液7.冰水浴【試驗步驟】1制管和預溫 由于本試驗對恒溫反應要求較高,故每個溫度梯度使用兩支試管, 分別標記為 A 管和 B管,同時欲溫底物與酶； A 管加入 PH6.8 的緩沖液和 0.5%淀粉液； B 管使用移液槍加入稀釋 100 倍的唾液,相對應的兩支試管置于設(shè)定的溫度下預溫 5min；取 12 支潔凈試管,參照下表加入試劑：A 管號1（0） 2（室溫） 3（37） 4（50） 5（70） 6（室溫）PH6.8的2 2 2 2 2 2 緩沖液（ml）用 2ml含 NaCl的 0.5%2 2 2 2 2 的蒸餾淀粉液水代替（ml

12、）B 稀釋 1001 1 1 1 1 1 倍的唾液（ml）替*6 號管為對比組（比色時作為0 號管）,置于室溫,且淀粉液用蒸餾水代2混合 A、B 管將 1 號 A 管試劑快速加入溫度對應的B 管中 為了最大限度保證酶的量 ,此時為計時的起點（使用秒表） ,搖勻后放回對應溫度連續(xù)水??；留意：轉(zhuǎn)移 A 管 試劑前需將其搖勻；3時間把握然后每隔 1min 或 2min（時間自定）按上步操作依次把 A、B管混合 ,嚴格把握好時間；2、3、4、5、6 號的4中止反應精確反應 13min,向 1 號管加入 2 滴 1M HCl 溶液,馬上混勻,中止反應,按上一步的次序和時間間隔依次對各管進行操作,并移至試

13、管架；后再各用2滴 1M NaOH溶液中和每管；5顯色在每管中各加入 2ml 0.03175g/L 6比色碘液并混勻,觀看現(xiàn)象；如不同溫度梯度間現(xiàn)象差別不明顯,就進行比色,通過光密度值來比較；【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象（或比較吸光度值） ,做出合理分析；【留意事項】嚴格留意時間的把握及各物質(zhì)的添加量；【摸索題】假如某同學 （沒有嚴格依據(jù)教案步驟） 做出的試驗結(jié)果為唾液淀粉酶的最適溫度 為 70 度,請分析他得出這樣的結(jié)果的可能緣由；試驗（三） PH對酶活性的影響【試驗目的】明白 PH對酶活性及酶促反應速度的影響,加深對酶特性的熟識；【試驗原理】 1.PH 對酶活性影響的機理： PH影響酶活性中心的某

14、些必需基團的解離 , 而這些 基團往往僅在某一解離狀態(tài)時才最簡潔同底物結(jié)合或具有最大催化活性；PH 影響可解離基團的底物和輔酶的荷電狀態(tài), 從而影響酶對他們的親和力； PH仍可以影響酶活性中心的空間構(gòu)象 , 從而影響酶的活性； 2. 本試驗用唾液淀粉酶為材料來觀看酶活性受PH的影響的情形；淀粉在該酶的催化作用下會隨著時間的延長而顯現(xiàn)不同程度的水解 , 從而得到各種糊精乃至 麥芽糖 , 少量葡萄糖等水解產(chǎn)物；碘液與淀粉及其不同程度的水解產(chǎn)物反應顯現(xiàn) 不同顏色 , 即淀粉 藍色 、紫色糊精 紫色 、紅色糊精 紅色 、麥芽糖及少量葡 萄糖 黃色 ；【儀器與試劑】儀器：1、冰箱2、電爐3、恒溫水浴鍋4、試管架及試管5、移液管架及移液管試劑：1、0.2M 磷酸氫二鈉溶液：稱取 定容至 1L；35.61g 含 2 個結(jié)晶水的磷酸氫二鈉,用水2、0.1M 檸檬酸溶液： 稱取 21.01g 含一個結(jié)晶水的檸檬酸, 用水定容至 1L；3、唾液淀粉酶：將唾液分別稀釋 的酶液、10 倍、50 倍和 100 倍,得三種不同濃度4、0.5% 淀粉的 0.5% 氯