結(jié)核病免疫學(xué)診斷新進(jìn)展

1、結(jié)核病免疫學(xué)診斷新進(jìn)展第1頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三March 24,2004,World TB dayWould you mind to clean thisDirty air by your lung?第2頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三結(jié)核病人的全球分布第3頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三第4頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三結(jié)核菌形態(tài)學(xué)改變正常結(jié)核菌第5頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三FIG. 1. Effect of anaerobic culture

2、 on the morphology of M.bovis BCG, M.tuberculosis, and M.smegmatis. (A) Longitudinal section of an M.bovis BCG bacillus cultured anaerobically for 6months showing pronounced cell wall thickening (some cytoplasmic dehydration is evident). (B) Transverse sections of M.bovis BCG bacilli cultured anaero

3、bically for 6months. (C) Lack of cell wall thickening in low-OD aerobically cultured M.bovis BCG bacilli. (D) NLSPC M.bovis BCG bacilli showing the absence of cell wall thickening. (E and F) Cell wall thickening in M.tuberculosis following anaerobic culture for 1month under mineral oil. (G) Aerobica

4、lly cultured M.smegmatis. (H) M.smegmatis bacilli exhibiting cell lysis following 35days of anaerobic culture. 細(xì)胞壁增厚第6頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三第7頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三37c,4 months without shaking in a loose caped Tube.細(xì)菌變小,呈顆粒狀或橢圓狀第8頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三人體免疫第9頁，共49頁，2022年，5月20日，11

5、點(diǎn)57分，星期三第10頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三結(jié)核性肉牙腫模型第11頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三第12頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三ESAT-6抗原的研究開發(fā)課題進(jìn)展報(bào)告第13頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三一）課題立項(xiàng)背景和意義課題年月立項(xiàng)，獲衛(wèi)生人才科技創(chuàng)新項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助萬元。第14頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三全球結(jié)核病疫情感染人數(shù) 2 億年新增加患病人數(shù) 8萬年結(jié)核病死亡人數(shù) 萬第15頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三中

6、國結(jié)核病疫情2000 全國流調(diào)感染率 44.5%，結(jié)核患病率 367/10 萬涂陽患病率 122/10 萬估計(jì)全國有結(jié)核病人 萬TB，Average death age 55.2Y第16頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三結(jié)核病診斷的冰山現(xiàn)象感染人群活動(dòng)性病人總?cè)丝诘?7頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三大量病人的診斷需要依靠結(jié)素試驗(yàn)第18頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三存在的主要問題，PPD不能區(qū)分卡介苗接種和結(jié)核菌感染。，我國卡介苗接種率超過。，存在有大量過診過治現(xiàn)象TB，Average death age 55.2Y

7、第19頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三年結(jié)核菌全基因測序的公布，為新診斷試劑的開發(fā)帶來了希望！第20頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三BCG在傳代過程中刪除了ESAT-6等基因，也就意味著，用它作診斷試劑，可以排除卡介苗接種的干擾。BCGESAT-6 CFP10RD1區(qū)TB第21頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三二）課題已經(jīng)取得的進(jìn)展一，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，表達(dá)和純化出了ESAT-6蛋白。二，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)三，人體試驗(yàn)。第22頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三一，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，表達(dá)和純化出了ESAT-6蛋

8、白。，質(zhì)粒構(gòu)建ESAT-6基因插入Vector;pQE30Primer 5 -TTG GGA TCC ATG ACA GAG CAG-3 ; : 5 -ATA AAG CTT CTA TGC GAA CAT CC-3 . PCR ampliWcations were done with 35 cycles at 94 C for 1min, 66 C for 1min, and 72 C for 1min, followed by a Wnal extension step at 72 C for 2min,第23頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三一，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，表

9、達(dá)和純化出了ESAT-6蛋白。2，篩選克隆第24頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三一，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，表達(dá)和純化出了ESAT-6蛋白。3，大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因大腸桿菌度封閉式搖床第25頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三一，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，表達(dá)和純化出了ESAT-6蛋白。，蛋白分離與純化系統(tǒng)P10純化柱粉碎用硅酸粉NI你NAT分離柱第26頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三一，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，表達(dá)和純化出了ESAT-6蛋白。，純化出ESAT-6蛋白第27頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三一，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，表

10、達(dá)和純化出了ESAT-6蛋白。，SDS蛋白表達(dá)確認(rèn)ESAT-6蛋白分子量約為.KD第28頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三二，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)小鼠品系；ICR感染途徑；H37Rv 或BCG 104 CFU尾緣靜脈內(nèi)注射皮膚試驗(yàn)；感染四周后，PPD 5u和ESAT-6蛋白2微克下肢腳墊內(nèi)注射。以腳腫張直徑為判斷標(biāo)準(zhǔn)。，動(dòng)物模型第29頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三二，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果PPD ESAT-6 PPD ESAT-6108642(mm)ESAT-6在結(jié)核菌和卡介苗感染組皮試結(jié)果有明顯差異。H37RvBCG第30頁，共49頁，2022年，5月20

11、日，11點(diǎn)57分，星期三三，人體試驗(yàn)。，文獻(xiàn)報(bào)道，活動(dòng)性結(jié)核皮試結(jié)果和干擾素水平有正相關(guān)第31頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三三，人體試驗(yàn)。2，外周血培養(yǎng)誘導(dǎo)干擾素實(shí)驗(yàn)操作程序第32頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三三，人體試驗(yàn)。PPD ESAT-6 PPD ESAT-6，志愿者皮試及外周血培養(yǎng)試驗(yàn)。皮試干擾素測定用于皮試結(jié)果陽性率較低第33頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三三，人體試驗(yàn)。，志愿者皮試及外周血培養(yǎng)試驗(yàn)。PPD強(qiáng)陽性例,PPD強(qiáng)陽患者中ESAT-6誘導(dǎo)干擾素陽性率第34頁，共49頁，2022年，5月20日，

12、11點(diǎn)57分，星期三四，研究結(jié)論，ESAT-6 不能用于皮膚試驗(yàn)，因?yàn)槿梭w試驗(yàn)顯示了較低的陽性率。（因?yàn)樘禺惛?，敏感性就低），外周血培養(yǎng)，誘導(dǎo)干擾素實(shí)驗(yàn)，顯示了良好的相關(guān)性。，臨床主要適用于菌陰結(jié)核病人的診斷。，與PPD實(shí)驗(yàn)相比，可以縮短診斷時(shí)間，減輕病人痛苦，提高正確診斷率。避免過診過治。第35頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三三），課題的將來研究計(jì)劃，課題以開發(fā)試劑盒為目的，為避免技術(shù)泄密，不提倡發(fā)表論文。，繼續(xù)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本，穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)條件。，ELISA試劑盒，存有成本高，價(jià)格貴的缺點(diǎn)，難以在基層推廣。我們希望與其他單位聯(lián)合，進(jìn)一步開發(fā)出操作簡單，價(jià)格便宜的診斷試紙條

13、。以便大面積推廣使用。第36頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三Study on Proinflammatory and Th1/Th2 Cytokines in Tuberculosis CasesZHANG Guolong1,2 MITSUYAMA Masao2 DU Changmei1 SHI Ruiru1 WANG Jiangdong1 GAO Feixu1 XIE Hongge11 Henan Anti-Tuberculosis Institute, Zhengchou, Henan, China2Department of Microbiology, Kyot

14、o University School of Medicine, Japan第37頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三 BACKGROUND Cytokines produced by macrophages and T cells are believed to be involved in both pathophysiology and disease outcome in human tuberculosis. Among various cytokines, interferon gamma (IFN-g) appears to be the most esse

15、ntial one for the resolution of the disease. IFN-g production is under the control of IL-12 and IL-18 released from the cells of macrophage lineage. Th1/Th2 balance is believed to be important for the resolution of tuberculosis. Pneumonia,tuberculosis and tumor are three major diseases in lung,somet

16、imes their x-ray shadows and symbols are quite similar,some cytokines might be useful for differential diagnosis The cytokine levels in the clinical specimen have not been examined well in China so far, and it appears to be useful to determine the levels of proinflammatory cytokines and Th1/Th2 cyto

17、kines in tuberculosis cases in China.第38頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三 Cytokine levels in the sera of patientsIL-8TNF-aIL-12IFN-gIL-18 RESULTS0.025.050.075.0100.0125.0150.0175.0200.0225.0250.0275.0300.0325.0350.0IL-6IL-8TNF-aIL-12IFN-gIL-18IL-10IL-4IFN-g RIL-12RTBCANCERHEALTHY2 區(qū)間移動(dòng)平均 (TB)2 區(qū)間移動(dòng)平均 (C

18、ANCER)2 區(qū)間移動(dòng)平均 (HEALTHY)第39頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三 Pro-inflammatory cytokine levels in sera0.020.040.060.080.0100.0120.0140.0IL-6IL-8TNF-acytokine level(pg/ml)TBCANCERHEALTHY*第40頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三 0.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0IL-12IFN-gIL-18Cytokine level (pg/ml)TBCANCERHEA

19、LTHYTh1 type cytokines in the sera*第41頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三 IL-12 receptor and IFN-g receptor levels in the sera0.050.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.0450.0IFN-gRIL-12Rlevel(pg/ml)TBCANCERHEALTHY*第42頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三 Th2 cytokine levels in the sera*第43頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分

20、，星期三 Comparison of cytokine levels between drug -resistant and -susceptible TB cases0.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0IL-6IL-8TNF-aIL-12IFN-gIL-18IL-10IL-4IFN- g RIL-12R-DS TB*DR TB第44頁，共49頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)57分，星期三 Comparison of cytokine levels between Smear-positive and -negative TB cases0.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0IL-6IL-8TNF-aIL-12IFN-gIL-18IL-10IL-4IFN- g RIL-12RTB+