常用蛋白還原劑變性劑

1、常用蛋白復(fù)原劑及變性劑常用蛋白復(fù)原劑及變性劑常用蛋白復(fù)原劑及變性劑常用蛋白復(fù)原劑1DTT中文名稱為二硫蘇糖醇（Dithiothreitol，簡稱為DTT），是蘇糖醇的C-1及C-4位羥基置換成巰基的化合物。在生化反響頂用做復(fù)原劑，保護蛋白質(zhì)或酶中的巰基不致氧化而失活。也常用于復(fù)原蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵等。DTT是一種小分子有機復(fù)原劑，化學式為C4H10O2S2。其復(fù)原狀態(tài)下為線性分子，被氧化后變成包含二硫鍵的六元環(huán)狀構(gòu)造。二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖（一種四碳單糖）DTT的異構(gòu)體為二硫赤糖醇（DTE），即DTT的C3-差向異構(gòu)體。DTT也經(jīng)常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的復(fù)原，可用于阻截蛋白質(zhì)中的半胱氨酸

2、之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。但DTT經(jīng)常沒法復(fù)原包埋于蛋白質(zhì)構(gòu)造內(nèi)部（溶劑不可及）的二硫鍵，這種二硫鍵的復(fù)原經(jīng)常需要先將蛋白質(zhì)變性（高溫加熱或加入變性劑，如6M鹽酸胍、8M尿素或1%SDS）。反之，依據(jù)DTT存在狀況下，二硫鍵復(fù)原速度的不同樣，。能夠判斷其包埋程度的深淺。-巰基乙醇英文名稱：-Mercaptoethanol，化學式：HOCH2CH2SH，分子量：78.13，是一種擁有特別臭味的無色透明液體，易燃、易溶于水和醇、醚等多種有機溶劑。-巰基乙醇(又稱為2-巰基乙醇、1-硫代乙二醇、2-羥基乙硫醇、-硫醇代乙醇）是一種有機化合物，其化學式為HOCH2CH2SH，英文通用縮寫

3、為ME或-ME。它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能團，為揮發(fā)性液體，擁有較激烈的刺激性氣味。-ME平常用于二硫鍵的復(fù)原，能夠作為生物學實驗中的抗氧化劑。它被廣泛使用的原由是它的羥基使它能夠溶解于水中，并且降低它的揮發(fā)性。因為擁有較低的蒸汽壓，它的難聞的狀況比起惡臭的硫醇要好得多。2-巰基乙醇能夠翻開蛋白質(zhì)中存在的二硫鍵：cysS-Scys+2HOCH2CH2SH2cysSH+HOCH2CH2S-SCH2CH2OH，二硫鍵被翻開后能夠使蛋白質(zhì)的四級或三級構(gòu)造被損壞。因為2-巰基乙醇能夠翻開蛋白質(zhì)的構(gòu)造，它經(jīng)常被用于蛋白質(zhì)分析。而2-巰基乙醇也經(jīng)常被用于保

4、護蛋白質(zhì)中自由的半胱氨酸巰基之間不會錯誤形成二硫鍵。作為復(fù)原劑，2-巰基乙醇經(jīng)常能夠與二硫蘇糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽（TCEP）交換使用。2-巰基乙醇是少量幾種被發(fā)現(xiàn)能夠延伸小鼠壽命的化合物。在微克量級水平上，2-巰基乙醇被察看到對實驗鼠的生命擁有多種可能的正面效應(yīng)。3.TCEP?化學名稱：三(2-羧乙基)膦；英文名稱：Tris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）；分子量：250.19。無色透明液體，不溶于脂肪烴，微溶于水，溶于醇、酮、酯、醚、苯、甲苯、二甲苯等，能與氯仿及四氯化碳混溶，與醋酸纖維素、硝酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、乙基纖維素、聚氯乙烯、

5、酚醛樹脂、聚丙烯酸酯等高聚物相容性好。TCEP是一種特別有效的硫醇類復(fù)原劑，寬泛用作蛋白質(zhì)化學及蛋白質(zhì)組學研究中二硫鍵的定量復(fù)原劑。該試劑在水溶液中的堅固性和溶解性都很好。在酸性、堿性溶液中的堅固性也不錯。與其余類其余硫醇類復(fù)原劑如DTT比較，TCEP不只是一種高效的二硫鍵復(fù)原劑，并且在某些巰基的交聯(lián)反響中不需要除去。因此在蛋白質(zhì)化學及蛋白質(zhì)組學研究經(jīng)常優(yōu)先選擇TCEP。TCEP在很寬的PH值范圍內(nèi)都能夠選擇性定量地復(fù)原哪怕水溶性很差的烷基類二硫化合物。平常室溫下反響不到5分鐘就能夠達成。TCEP沒有難聞的氣味，并且在空氣中不怕氧化。增補：DTT，beta-巰基乙醇，TCEP等是巰基類復(fù)原劑。

6、復(fù)原劑能夠保護蛋白質(zhì)上自由的巰基不被氧化，進而防范蛋白質(zhì)的齊集或變性。在結(jié)晶實驗中，一般使用的復(fù)原劑工作濃度是110mM。beta-巰基乙醇是上述三種復(fù)原劑中復(fù)原能力最差的一個，因為它自己只有一個巰基。它的見效一般只好保持23天。因此，在實驗中要每隔23天補加一次beta-巰基乙醇來維持它的作用。因為beta-巰基乙醇是揮發(fā)性的，因此，能夠在池液中加入beta-巰基乙醇，利用它的揮發(fā)擴散到液滴中去。二硫蘇糖醇DTT有兩個巰基基團，其作用能保持37天。DTT的揮發(fā)性不像beta-巰基乙醇那么強，因此使用時應(yīng)當直接加入到懸滴中去。DTT還能夠夠經(jīng)過微透析的方法加入。TCEP的復(fù)原能力比使結(jié)晶用的緩

7、沖液酸化。與beta-巰基乙醇和DTT近似，DTTTCEP都強，它的作用能夠保持23周。TCEP需要直接加入到懸滴中，因此能夠考慮微透能析法。beta-巰基乙醇，DTT，和TECP的作用系統(tǒng)可能不同樣。像其余增添劑同樣，假如你發(fā)現(xiàn)一類物質(zhì)對樣品的堅固性和結(jié)晶有益，則能夠去優(yōu)選這一類物質(zhì)中最合適你的樣品的一種。我們建議是，最好這三種復(fù)原劑都試一試試看，去發(fā)現(xiàn)最合適的。復(fù)原劑能夠與金屬離子聯(lián)合，金屬離子其被復(fù)原，而復(fù)原劑的作用被控制。這就使得用重金屬原子作同晶置換法碰到了麻煩。能夠使用EDTA來防范復(fù)原劑被金屬離子控制。但是，假如金屬離子是你的樣品蛋白保持活性所必然的，就要當心使用EDTA了。堿性

8、條件下，beta-巰基乙醇和TECP更堅固，見效要好于DTT。酸性條件下，TCEP的堅固性也要好過DTT。DTT能夠使Ni被復(fù)原，因此在用Ni柱純化His標簽的蛋白時要防范使用DTT，而應(yīng)該考慮beta-巰基乙醇和TECP。半胱氨酸也是一種復(fù)原劑。在結(jié)晶實驗中，半胱氨酸限制性很顯然，那是因為它簡單形成六角形的晶體?？墒牵腚装彼崾且环N有效的增添劑，能帶來顯然的見效，可是需要銘刻它的限制性。假如預(yù)期到蛋白會被氧化，從制備樣品開始就要加入復(fù)原劑，并且在整個流程中要不停補加保證其見效。在懸滴法中，能夠在池液里加入復(fù)原劑，利用復(fù)原劑的揮發(fā)擴散，保證懸滴中復(fù)原性的環(huán)境。在確立復(fù)原劑和樣品比率時，需要考慮

9、樣品上自由巰基的數(shù)量和樣品濃度。自由巰基數(shù)目越多，樣品濃度越高，復(fù)原劑的用量就越大。含砷化合物與復(fù)原劑不可以夠共用。二甲胂和二甲胂酸鈉是結(jié)晶中常使用的含砷化合物，它們不可以夠與復(fù)原劑共同使用。其余不可以夠與復(fù)原劑一同使用的物質(zhì)還包含：硝酸銨，過氧化氫，高氯酸鉀，硝酸鈉。在使用某種物質(zhì)以前，應(yīng)當先查閱MaterialSafetyDataSheet(MSDS)。4.SDSSDS是一種陰離子去污劑，它能損壞蛋白質(zhì)分子之間以及其余物質(zhì)分子之間的非共價鍵。在強復(fù)原劑如巰基乙醇或二硫蘇糖醇的存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被翻開并解聚成多肽鏈。解聚后的蛋白質(zhì)分子與SDS充分聯(lián)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合

10、物，復(fù)合物所帶的負電荷大大超出了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就除去了不同樣蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差別，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在溶液中的形狀像一個長橢圓棒。SDS不只好夠分別判斷蛋白質(zhì)，并且能夠依據(jù)遷徙率大小測定蛋白質(zhì)亞基的分子量。DTT和巰基乙醇比較，作用相像，但低好多。并且DTT比巰基乙醇的濃度低DTT的刺激性氣味要小好多，毒性也比巰基乙醇7倍時，二者見效周邊。但DTT價錢略高一些。DTT有兩個巰基公司，巰基乙醇只有一個巰基公司。常用蛋白變性劑鹽酸胍和尿素尿素和鹽酸胍在高濃度(48mol/L)水溶液時能斷裂氫鍵，進而使蛋白質(zhì)發(fā)生不同樣程度的變性。同事，還能夠夠經(jīng)過增大疏水基酸性殘基在水相中的溶

11、解度，降低疏水互相作用。在室溫下46mol/L尿素和34mol/L鹽酸胍，可使球狀蛋白質(zhì)從天然狀態(tài)轉(zhuǎn)變至變性狀態(tài)的中點，平常增添變性劑濃度可提升變性程度，平常8mol/L尿素的變性能力強。一些球狀蛋白質(zhì)，甚至在8mol/L尿素溶液中也不可以夠完滿變性，可是在8mol/L鹽酸胍溶液中，他們一般以無規(guī)則卷曲(完滿變性)構(gòu)象狀態(tài)存在。尿素和鹽酸胍惹起的變性包含兩種系統(tǒng)：1、變性蛋白質(zhì)能與尿素和鹽酸胍優(yōu)先聯(lián)合，形成變性蛋白質(zhì)-變性劑復(fù)合物，當復(fù)合物被除去，進而惹起ND反響均衡向右挪動。隨著變性劑濃度的著呢國家，天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)不停轉(zhuǎn)變成復(fù)合物，最后致使蛋白質(zhì)完滿變性?？墒牵驗樽冃詣┡c變性蛋白的聯(lián)合是特別弱的。因此，只有高濃度的變性劑才能惹起蛋白質(zhì)完滿變性；2、尿素與鹽酸胍對誰說氨基酸殘基的增溶作用。因為尿素和鹽酸胍都擁有形成氫鍵的能力，當他們在高濃度時，能夠損壞水的氫鍵構(gòu)造，結(jié)果尿素和鹽酸胍就成為非極性