基因工程步驟

1、基因工程步驟真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)下游調(diào)控遺傳信息的表達(dá)(調(diào)控序列)外顯子(能編碼蛋白質(zhì))內(nèi)含子(不能編碼蛋白質(zhì))啟動(dòng)子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345轉(zhuǎn) 錄mRNA前體成熟mRNA加 工切除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄部分原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定一、目的基因的獲取 用3分鐘閱讀P8-11，并思考下列問(wèn)題，然后用2分鐘與同桌交流、討論。1、獲取目的基因

2、的常用方法有哪些?2、何謂基因文庫(kù)？其類(lèi)型有哪幾種？3、如何構(gòu)建基因文庫(kù)？4、何謂PCR技術(shù)？其原理、條件和過(guò)程是怎樣的？一、目的基因的獲取1、目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2、獲取方法：（1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因；（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因；（3）通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成3、基因文庫(kù) 又稱(chēng)DNA文庫(kù)，將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，所有受體菌的集合即為該生物的基因文庫(kù)?；蛭膸?kù)由外源DNA片段、載體和宿主組成。按外源DNA片段的來(lái)源分基因文庫(kù)分為：基因組DN

3、A文庫(kù)：包含了某物種的所有的基因部分基因文庫(kù)：只包含了部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)）1）載體DNA片段的制備 DNA分離純化限制酶切2）供體DNA片段的制備總DNA分離純化酶切法分離特定大小DNA片段3）載體與基因組DNA片段的連接4）重組DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞4.基因文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)的構(gòu)建通過(guò)對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 （反轉(zhuǎn)錄法） 目的基因的mRNA單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)接到載體基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以

4、部分基因可以思考：怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因？ 根據(jù)基因的有關(guān)信息如根據(jù)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA、基因的核苷酸序列、基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等來(lái)獲取目的基因。2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR 概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)，是一項(xiàng)在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù) 條件：_ _、 _ 、 _原理：_方式：以_方式擴(kuò)增，即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制已知基因的核苷酸序列(前提條件)四種脫氧核苷酸成對(duì)引物DNA聚合酶(Taq酶）指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增過(guò)程：a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_斷裂

5、，形成_b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的_。 氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈PCR的基本反應(yīng)步驟變性90-95C延伸70-75C退火55-60CPCR總結(jié)：3、化學(xué)方法人工合成目的基因 基因比較小,已知核苷酸序列，直接利用DNA合成儀用化學(xué)方法合成，不需要模板。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成從基因文庫(kù)中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基

6、因DNA 連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種 限制酶 目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。1、基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法2.基因表達(dá)載體的目的（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。3、基因表達(dá)載體的組成：a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因等思考：它們有什么作用？ 表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能有利于基因的表達(dá)。（2）通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無(wú)法轉(zhuǎn)錄。終止子的作用是什么？ 終止子是位于基因尾端的一段特殊的

7、DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。 是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。標(biāo)記基因有什么作用？1、原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2、方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射法感受態(tài)細(xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點(diǎn)： 易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力原理： Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。轉(zhuǎn)化過(guò)程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 基因槍法又稱(chēng)微彈轟擊

8、法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法單子葉植物適用此方法（3）花粉通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。適用于被子植物胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞程序：目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物方法：顯微注射法微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、 遺傳物質(zhì)相對(duì)少過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定分子水平檢測(cè):是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯個(gè)體生物學(xué)水平鑒定1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物