CFSE法檢測(cè)刺激劑對(duì)淋巴細(xì)胞增殖與活化

1、CFSE法檢測(cè)刺激劑對(duì)淋巴細(xì)胞増殖與活化薛妮娜;董凱;來芳芳;黃蕊;陳曉光【摘 要】研究不同刺激劑對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞增殖與活化的影響.采用密度離心法 分離人外周血淋巴細(xì)胞,并采用1pmol/L的CFSE進(jìn)行標(biāo)記，通過流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)檢 測(cè)刺激劑抗CD3/28抗體、植物血凝素(PHA)和佛波酯(PMA)培養(yǎng)72 h對(duì)淋巴細(xì) 胞分裂與增殖的影響并采用ELISA法檢測(cè)不同刺激劑對(duì)淋巴細(xì)胞上清IFNy質(zhì)量 濃度的影響.0.125 pg/mL的抗CD3/28抗體和5或10 pg/mL的PHA可以顯著 誘導(dǎo)CFSE綠色熒光逐漸遞，形成類似五指峰樣圖譜,說明這兩者具有很強(qiáng)的誘導(dǎo) 淋巴細(xì)胞分裂與增殖的作用相比之

2、下，單用PMA促進(jìn)淋巴細(xì)胞分裂與增殖的作用 較弱此外，抗CD3/28抗體、PHA和PMA均可增加淋巴細(xì)胞IFNy的分泌，但其作 用強(qiáng)度如下:抗CD3/28抗體PHAPMA采用CFSE標(biāo)記法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖的 實(shí)驗(yàn),得出抗CD3/28抗體和PHA是高效的淋巴細(xì)胞活化刺激劑，而且最佳質(zhì)量濃 度分別為 0.125 pg/mL 和 10 pg/mL.%The aim of this paper is to investigate the effect of different stimulants on the proliferation and activation of human periphe

3、ral blood lymphocytes. Human peripheral blood lymphocytes were isolated by density centrifugation and labeled with CFSE with the final concentration of 1pmol/L. Flow cytometry analysis was used to detect the division and proliferation of lymphocytes after administration of anti-CD3/28 antibody, phyt

4、ohemagglutinin (PHA) and phorbol ester (PMA) for 72 h. In addition, IFNy content that reflects the activation of T lymphocytes was detected by ELISA method.And found that 0.125pg/mL of anti-CD3/28 antibody and 5 or 10pg/mL of PHA could induce the gradual reduction of green fluorescence, with a Multi

5、-peak pattern inflow cytometry analysis, the results indicated that both anti-CD3/28 antibody and PHA are potential had strong stimulants for lymphocyte division and proliferation. In comparison, the role of PMA alone in promoting lymphocyte division and proliferation was weak. Furthermore, anti-CD3

6、/28 antibody, PHA and PMA almost could increase the IFNy secretion from lymphocytes. However, anti-CD3/28 antibody was the most stimulator,PHA, and PMA was the weakest agent for stimulating the production of IFNy in lymphocytes. In the CFSE-based proliferative assays for assessment of T cell functio

7、n, this paper concluded that both anti- CD3/28 antibody and PHA were effective stimulants for the proliferation and activation of lymphocytes, with the optimal concentrations of 0.125 pg/mL and 10 pg/mL, respectively.期刊名稱】哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)期刊名稱】哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)年(卷),期】2017(033)002【總頁數(shù)】6頁(P129-134)【關(guān)鍵詞】

8、淋巴細(xì)胞增殖；CFSE；干擾素Y；流式細(xì)胞術(shù)【作 者】 薛妮娜;董凱;來芳芳;黃蕊;陳曉光【作者單位】 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室/創(chuàng)新藥物非臨床藥物代謝及PK/PD研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050;中國 醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/創(chuàng)新藥物非臨床 藥物代謝及PK/PD研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050沖國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究 所,天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/創(chuàng)新藥物非臨床藥物代謝及PK/PD 研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050;中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,天然藥物活性物 質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/創(chuàng)新藥

9、物非臨床藥物代謝及PK/PD研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室,北京 100050;中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí) 驗(yàn)室/創(chuàng)新藥物非臨床藥物代謝及PK/PD研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050【正文語種】中文中圖分類】R446腫瘤免疫治療己成為繼手術(shù)、化療和放療之后的第四種常用的腫瘤治療方法.腫瘤 免疫治療是通過激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫能力， 從而控制和殺滅腫瘤細(xì)胞而效應(yīng)T淋巴細(xì)胞是誘發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要 執(zhí)行者，行使對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和消滅作用1.在腫瘤進(jìn)展過程中，腫瘤細(xì)胞通過 上調(diào)一些免疫檢查點(diǎn)分子的配體，與T淋巴細(xì)胞表面這些共抑制性受體

10、(PD1、CTLA4、LAG3等)相互作用，從而抑制T細(xì)胞的增殖與活化，形成腫瘤免疫逃逸 微環(huán)境2-3.目前，絕大多數(shù)上市或處于臨床研究階段的抗腫瘤免疫藥物都是通過 抑制T細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控信號(hào)，通過激活T淋巴細(xì)胞的增殖和活性，強(qiáng)化T細(xì)胞的 免疫應(yīng)答，最終達(dá)到抵御腫瘤細(xì)胞增長的目的.因此，T淋巴細(xì)胞的增殖與活性水 平的檢測(cè)是細(xì)胞免疫功能研究的常用方法，也是目前抗腫瘤免疫藥物研發(fā)中一個(gè)重 要的考察指標(biāo)4.氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法被廣泛用于淋巴細(xì)胞增殖的檢測(cè)但是其需要 使用放射性同位素標(biāo)記，具有潛在的污染，并且不容易大批量操作.其次，還有一 些研究者采用MTT或MTS的方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞

11、增殖雖然MTT或MTS的操作方 法相對(duì)簡(jiǎn)單，但靈敏性不高，且此方法不適合檢測(cè)一些具有氧化還原性作用的藥物， 這類藥物可直接與MTT反應(yīng)，造成假陽性此外，3H-TdR摻入法和MTT/MTS法 均是以細(xì)胞的數(shù)量來反應(yīng)增殖的變化，不能反應(yīng)細(xì)胞的分裂情況，且無法測(cè)定不同 亞群淋巴細(xì)胞的增殖情況5-6羧基熒光素乙酰乙酸(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester, CFSE )染色是一種有效的檢測(cè)淋巴細(xì)胞分裂與增殖 的方法.CFSE可穿過細(xì)胞膜，不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基共價(jià)結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞內(nèi)蛋白. 在細(xì)胞分裂增殖過程中，CFSE標(biāo)記的熒光可平均分配到兩個(gè)子

12、代細(xì)胞中，出現(xiàn)連 續(xù)的熒光強(qiáng)度遞減現(xiàn)象，在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過程中出現(xiàn)類似“五指峰”的特征7- 8.抗CD3/28抗體、刀豆蛋白A(ConA)、植物血凝素(PHA)佛波酯(PMA)可刺激小 鼠脾或人外周血T淋巴細(xì)胞增殖目前，文獻(xiàn)中尚未對(duì)這些刺激劑促進(jìn)T淋巴細(xì)胞 增殖的強(qiáng)度進(jìn)行比較.而且報(bào)道的這些刺激劑的最佳有效劑量也不盡相同.因此，本 文采用CFSE標(biāo)記法檢測(cè)不同刺激劑誘導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞分裂與增殖的活性，為 驗(yàn)證腫瘤免疫藥物的活性提供有效的評(píng)價(jià)方法.全血 健康志愿者的抗凝血購自中國食品藥品檢定研究院.主要試劑人外周血淋巴細(xì)胞提取分離液購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司.CFSE、PMA、和PHA購自Si

13、gma公司，人源抗CD3、CD28抗體購自美國Miltenyi?Biotec公司. 人源IFN y的ELISA檢測(cè)試劑盒購自cloud-clone公司.RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛 血清購自美國GIBCO公司.主要儀器FACSVerse流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，Synergy H1多功能酶標(biāo)儀為美國 Bio-Tek公司產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱為日本三洋公司產(chǎn)品，冷凍離心機(jī)為美國Sigma 公司產(chǎn)品.淋巴細(xì)胞的制備將健康志愿者的抗凝血與PBS混合，再緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液中(這三者的終體 積比例為1:1:1）,室溫，800 r/min離心30 min,小心吸取中間的一層薄而致密 的白膜（淋巴細(xì)胞層

14、）至另一層離心管中，用PBS重懸洗滌2次，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞 濃度為1x107/mL.CFSE標(biāo)記淋巴細(xì)胞在上述淋巴細(xì)胞懸液中加入CFSE染液（CFSE，終濃度為1 pmol/L）,37 C避光孵 育10 min ,每5 min混勻細(xì)胞加入預(yù)冷的2 mL滅活牛血清冰上終止2 min , 1 500 r/min離心5 min，用預(yù)冷的含10%滅活胎牛血清的PBS洗滌2次離心，用 含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞調(diào)整為3x106/mL,加 入96孔圓底板，每孔100 mL,洗滌及離心過程中注意避光.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖活性向上述接種至96孔圓底板的淋巴細(xì)胞中分別加入10

15、0 mL含不同劑量的刺激劑的 RPMI1640完全培養(yǎng)基：抗CD3/28抗體（終質(zhì)量濃度：0.125、0.5、1、1.5 pg/mL）、PHA（終質(zhì)量濃度：1、5、10 pg/mL）和 PMA（終質(zhì)量濃度：1、5、10 ng/mL）.每組實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行孔，置于37C, 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育72h. 離心，收集細(xì)胞上清，凍于-80 C冰箱保存將細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌2次，并用 200 pL PBS重懸，采用流式細(xì)胞檢測(cè)儀（BD FACS Verse ）檢測(cè)淋巴細(xì)胞的分裂和 增殖情況，并采用Flowjo 7.6軟件計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖情況（CFSE熒光強(qiáng)度減低的 細(xì)胞百分比）和分裂指數(shù)（CFS

16、E熒光強(qiáng)度減低的細(xì)胞百分比與CFSE熒光強(qiáng)度不變 的細(xì)胞百分比的比值）.ELISA法檢測(cè)淋巴細(xì)胞上清IFNy質(zhì)量濃度取上述條件下淋巴細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測(cè)IFNy的質(zhì)量濃度操作步驟參 照試劑盒說明書簡(jiǎn)要步驟如下：1）加入100 pL倍比稀釋的人源IFNy標(biāo)準(zhǔn)品及淋 巴細(xì)胞上清原液，室溫靜置1 h ; 2）充分棄上清，分別加入1:100稀釋的IFNy 的一抗，室溫靜置1 h ; 3）棄上清，洗滌三次后，加入1:100稀釋后的IFNy的 二抗，室溫靜置30 min ; 4)棄上清，洗滌5次后，加90 pL底物(TMB)顯色，室 溫避光放置15 min ; 5)加50 pL的硫酸終止反應(yīng)；

17、6)酶標(biāo)儀450 nmol/L下檢測(cè) 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFNy的含量.統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)采用Mean士SD表示，用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析， PS0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.3.1 CFSE法淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞門的確定采用Flowjo 7.6軟件對(duì)淋巴細(xì)胞分裂與增殖進(jìn)行分析.根據(jù)前向散射角(FSC)和側(cè) 向角散射(SSC)顯示圖，發(fā)現(xiàn)排除了細(xì)胞碎片群外，在正常條件下，淋巴細(xì)胞主要 分布為左下群，均一度較好的一簇細(xì)胞群.在接受不同刺激劑活化后，左下的淋巴 細(xì)胞群開始往右上方移動(dòng)，且出現(xiàn)比較散在的細(xì)胞群.根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)的原理，我 們認(rèn)為在刺激劑活化淋巴細(xì)胞后，淋巴細(xì)胞出現(xiàn)不同程度

18、的分裂和增殖，其細(xì)胞大 小和均一度都發(fā)生改變，從而顯示在右上方散在的細(xì)胞群.我們把原始淋巴細(xì)胞命 名為R1門，刺激劑活化后的淋巴細(xì)胞命名為R2門(如圖1(A) (B)所示)且在正常 條件下，R1門的細(xì)胞具有強(qiáng)的CFSE染色熒光(單峰)；在刺激劑作用下，R2門內(nèi) 增殖的淋巴細(xì)胞出現(xiàn)逐漸遞減的CFSE染色熒光(多峰)(如圖1(C) (D)所示).3.2抗CD3/28抗體對(duì)淋巴細(xì)胞分裂與增殖活性的影響抗CD3和CD28抗體分別在體外模擬特異性T淋巴細(xì)胞活化的第一信號(hào)和第二信 號(hào)，是T淋巴細(xì)胞活化常用的刺激劑我們采用CFSE染色，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 抗CD3和CD28抗體對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響如圖2(A

19、) (B)所示，抗CD3/28抗 體可以強(qiáng)效地誘導(dǎo)綠色熒光強(qiáng)度逐漸遞減，形成類似“五指峰”樣圖譜，說明抗 CD3/28抗體可以顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞分裂和增殖且在0.125 1.5 pg/mL劑量范 圍內(nèi)，抗CD3/28抗體誘導(dǎo)的“五指峰”圖幾乎重疊對(duì)其增殖指數(shù)和分裂指數(shù)進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)，如圖2(C) (D)所示，0.125 1.5 pg/mL的抗CD3/28抗體誘導(dǎo)淋巴細(xì) 胞增殖百分比基本可達(dá)到75%(PSO.OO1),其誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)可達(dá)3倍 (PS0.001).但隨著抗CD3/28抗體質(zhì)量濃度的增加，1.5 pg/mL的抗CD3/28抗 體誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)反而有所下降.因此，在誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞

20、增殖實(shí)驗(yàn)中，選用 終質(zhì)量濃度為0.125 pg/mL的抗CD3/28抗體即可.PHA對(duì)淋巴細(xì)胞分裂與增殖活性的影響PHA是一種有絲分裂原，主要用于激活淋巴細(xì)胞對(duì)PHA的不同質(zhì)量濃度進(jìn)行分 析表明，PHA可以劑量依賴性地促進(jìn)淋巴細(xì)胞分裂與增殖.1 pg/mL的PHA促進(jìn) 淋巴細(xì)胞增殖和分裂指數(shù)分別為40.9%和0.69倍.當(dāng)質(zhì)量濃度為10 pg/mL 時(shí)， PHA促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的效果最為明顯，淋巴細(xì)胞增殖和分裂指數(shù)為85.7%和 4.7倍(如圖3所示).PMA對(duì)淋巴細(xì)胞分裂與增殖活性的影響PMA是PKC信號(hào)的激活物，PKC信號(hào)在T淋巴細(xì)胞活化中占據(jù)重要地位所以PMA 也是 T 淋巴細(xì)胞活化常用

21、刺激劑之一.對(duì) PMA 的不同質(zhì)量濃度進(jìn)行分析表明， 雖然PHA也可劑量依賴性地促進(jìn)淋巴細(xì)胞分裂與增殖，但其誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖能 力較弱，5 ng/mL和10 ng/mL的PMA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)才到達(dá)20%，此 劑量下的分裂指數(shù)才達(dá)到0.2倍(如圖4所示).3.5不同刺激劑對(duì)淋巴細(xì)胞IFNy分泌的影響收集不同刺激劑培養(yǎng)淋巴細(xì)胞72h后的上清液，采用ELISA法檢測(cè)IFNy的質(zhì)量 濃度如圖 5 所示,0.125 pg/mL 抗 CD3/28 抗體、10 pg/mL PHA 和 10 ng/mL PMA均可顯著增加淋巴細(xì)胞IFNy的分泌(PS0.001)但其增加淋巴細(xì)胞IFNy分泌 量的順序是抗

22、CD3/28抗體PHAPMA.淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能的常用方法.CFSE染色法是近年來廣泛代替 3H-TdR摻入法和MTT顯色法的一種快速、無污染的檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖的方 法.CFSE染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)能在不同淋巴細(xì)胞亞群及單個(gè)細(xì)胞水平上動(dòng)態(tài)的 分析淋巴細(xì)胞增殖情況9-11.小分子藥物單獨(dú)作用在體外幾乎不刺激淋巴細(xì)胞增殖，需要在淋巴細(xì)胞活化的基礎(chǔ) 上，進(jìn)一步評(píng)價(jià)小分子藥物調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖的作用因此，采用CFSE法，尋找 不同刺激劑活化淋巴細(xì)胞的最佳劑量，是評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖的小分子藥物的必 要前提本實(shí)驗(yàn)采用人外周血提取獲得淋巴細(xì)胞，在不同劑量的抗CD3/28抗體、 PHA和PM

23、A作用下，觀察淋巴細(xì)胞的增殖和分裂指數(shù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，比以往報(bào)道 用量更低的抗CD3/28抗體(0.12 5pg/mL)即可高效的刺激T淋巴細(xì)胞的分裂與增 殖12.5 pg/mL的PHA促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和分裂指數(shù)分別為75%和3倍，這與 Fulcher D等研究者的報(bào)道一致7.由于PHA可以劑量依賴性地增加淋巴細(xì)胞增殖 與分裂，可根據(jù)需要活化的淋巴細(xì)胞的強(qiáng)弱選擇合適的PHA的劑量，同時(shí)，PHA 又便宜因此，PHA可用于調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖的化合物的大量篩選相比之下，PKC 信號(hào)的激動(dòng)劑PMA促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的能力較弱可能是因?yàn)門淋巴細(xì)胞的活化 需要PKC信號(hào)和Ca2+信號(hào)共同參與，因此單一的PMA對(duì)淋

24、巴細(xì)胞的活化作用 較弱，需要與離子霉素聯(lián)用(Ca2+激動(dòng)劑)可能對(duì)顯示出更強(qiáng)的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖 的活性這與Castagna M等人的研究相一致13.IFNy是T淋巴細(xì)胞活化的重要 指標(biāo)14-15.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗CD3/28抗體、PHA和PMA都能顯著增加淋巴細(xì)胞 IFNy的分泌，也證明了這三類刺激劑對(duì)T淋巴細(xì)胞的活化作用并且這三種刺激劑 增加IFNy的分泌的程度與其誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂與增殖的程度相對(duì)應(yīng).后續(xù)將進(jìn)一步 研究這些刺激劑對(duì)不同亞群T淋巴細(xì)胞的促增殖作用.【相關(guān)文獻(xiàn)】 LANITIS E, POUSSIN M, KLATTENHOFF a W, et al. Chimeric an tige

25、n receptor T Cells with dissociated signaling domains exhibit focused antitumor activity with reduced pote ntial for toxicity in vivo J. Can cer imm uno logy research, 2013, 1(1): 43-53.YAO S, ZHU Y, CHEN L. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation J. Nature revi

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